Name: Rekonstitution der Myosin-I-vermittelten verzweigten Aktin-Assemblierung in einem Bead-basierten Assay zur Motilität von Aktin-Kometenschweifen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Rekonstitution der Myosin-I-vermittelten verzweigten Aktin-Assemblierung in einem Bead-basierten Assay. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Aktin-Netzwerk-Dynamik und Kraftgenerierung an membranähnlichen Grenzflächen.

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Wir danken Dr. Daniel Safer und Rick Wike für hervorragende technische Unterstützung bei der Proteinaufreinigung. Wir danken Dr. Roberto Dominguez, insbesondere Dr. Malgorzata Boczkowska und Dr. Grzegorz Rebowski, für die großzügige Bereitstellung des Arp2/3-Komplexes und der CapZ-Proteine. Wir danken außerdem Dr. Luther Pollard, Dr. Faviolla A. Báez-Cruz und allen Mitgliedern der Labore von Ostap und Dominguez für ihre wertvollen Beiträge während des gesamten Projekts. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health (R37 GM057247, an E.M.O.) unterstützt. E.M.O. und M.X. erhielten teilweise Förderung durch die National Science Foundation (CMMI-1548571). ChatGPT wurde zur Unterstützung bei der sprachlichen Überarbeitung während der Manuskriptrevision verwendet. Die Autoren haben alle KI-unterstützten Inhalte überprüft und bearbeitet und übernehmen die volle Verantwortung für das endgültige Manuskript.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte haben.

Der Aktin-Komet-Schwanz-Perlen-Motilitätsassay ist ein etabliertes in vitro-Rekonstitutionssystem zur Untersuchung der Arp2/3-Komplex-vermittelten verzweigten Aktin-Assembly und ihrer Rolle bei der Erzeugung vorwärtstreibender Kräfte14,15,16,17. Dieses System wurde umfassend genutzt, um die biochemische Regulation der verzweigten Aktin-Assembly14,15,26,27,31,49,50,51 und die Kraftentfaltung20,21,22,23,52 aufzuklären, und bietet gleichzeitig einen Rahmen für quantitative Studien zu den emergenten aktiven Materialeigenschaften von Aktinnetzwerken19,35,36,53. Durch die Einbindung von Myosin, insbesondere Myosin-I18, in dieses rekonstituierte System ermöglicht der modifizierte Assay die Untersuchung, wie die Kopplung von Myosin und Aktin die Aktin-Assembly und Kraftentfaltung an der Membrangrenzfläche moduliert – ein Bereich, der bisher vergleichsweise wenig erforscht ist. Bemerkenswerterweise kann Myosin-I in diesem System leicht durch andere Myosin-Motoren ersetzt werden, um deren jeweilige Funktionen bei der Umbildung von Aktinnetzwerken und der Kraftentfaltung zu untersuchen. Beispielsweise könnten Myosin V (Transport von Frachtstoffen)54, Myosin VI (endozytotischer Transport und Membrandyamik)55,56, Myosin VII und XV (Organisation von Stereozilien und Mikrovilli)57,58,59, Myosin X (Bildung von Filopodien)60,61 sowie Myosin XIX (Dynamik der Mitochondrien)62 eingebaut werden, um zu erforschen, wie verschiedene Myosin-Klassen zur Aktinorganisation und den damit verbundenen physiologischen Prozessen beitragen.
Der Assay ist hochgradig reproduzierbar, vorausgesetzt, dass mehrere kritische Parameter sorgfältig kontrolliert werden. Erstens ist hochwertiges monomeres G-Aktin entscheidend für eine robuste Bildung von Kometenschwänzen. Wir empfehlen, G-Aktin aus Acetonpulver von Kaninchen-Skelettmuskel nach etablierten Protokollen zu reinigen41. Nach 2–3 Tagen Dialyse sollte monomeres Aktin durch Gelfiltration auf Sephacryl S-300 in G-Puffer (2 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,2 mM ATP; 0,1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; und 0,5 mM DTT) weitergereinigt werden. Die Fraktionen, die unmittelbar nach dem Elutionspeak gesammelt werden, sollten verwendet werden. Gereinigtes G-Aktin behält typischerweise über 2–3 Wochen hinweg eine starke Polymerisationsaktivität, wenn es auf Eis bei 4 °C gelagert wird, und kann bis in die vierte Woche hinein verwendbar bleiben, obwohl die Leistung danach im Allgemeinen abnimmt. Eine verminderte Robustheit der Kometenschwänze, gekennzeichnet durch spärliche, spröde Aktinnetzwerke und inkonsistentes Schwanzwachstum, weist oft auf eine beeinträchtigte Aktinqualität hin. Zweitens bestimmt die NPF-Aktivität entscheidend die Bildung der Kometenschwänze. Kommerziell erhältliche GST-markierte WCA-Domäne aus dem humanen neuronalen Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein (N-WASP) (GST-VCA) liefert eine robuste und anhaltende Nukleationsaktivität, wobei die GST-Dimerisierung diese Aktivität weiter verstärkt63. Wir empfehlen, jeden NPF-Konstrukt mithilfe eines Pyren-Aktin-Polymerisationsassays vor der Beschichtung der Kügelchen zu validieren. Die Aktivität des kommerziellen GST-VCA kann dabei als Referenzstandard dienen. Bemerkenswerterweise fehlt dem hier verwendeten kommerziellen GST-VCA ein Polyprolinabschnitt und es interagiert daher nicht mit Profilin-Aktin-Komplexen26. Drittens erfordert die zuverlässige Visualisierung des Kometenschwanzwachstums eine sorgfältige Vorbereitung von Objektträger und Deckglas. Wir empfehlen, Objektträger und Deckgläser gründlich mit Wasser und Ethanol zu reinigen und unmittelbar vor der Verwendung einer Plasmareinigung zu unterziehen. Sofern verfügbar, sind Polyethylenglykol-silanierte Deckgläser26 vorzuziehen, da sie die unspezifische Proteinaufnahme minimieren und die Reproduzierbarkeit verbessern. Die Zugabe einer ausreichenden Konzentration von BSA in die Beweglichkeitsmischung kann unspezifische Oberflächenwechselwirkungen weiter verringern und eine konsistente Assayleistung fördern. Viertens ist das Volumen der Probe, die auf die Messkammer aufgebracht wird, entscheidend für zuverlässige Messungen15,16,17. Ein zu großes Proben­volumen führt zu wandernden Kügelchen, wodurch eine genaue Verfolgung der Kometenschwanzverlängerung verhindert wird. Im Gegensatz dazu komprimiert ein zu geringes Proben­volumen die Kügelchen zwischen Objektträger und Deckglas, erhöht die Reibung und immobilisiert die Kügelchen. Diese mechanische Einschränkung kann die Morphologie der Kometenschwänze verzerren und die gemessenen Wachstums­kinetiken verändern. Daher ist die Optimierung sowohl der Kammerhöhe als auch des Proben­volumens für reproduzierbare Ergebnisse unerlässlich. Wir empfehlen, das Proben­volumen für jeden experimentellen Aufbau empirisch zu optimieren. Bei Verwendung eines 22 mm × 22 mm großen Deckglases, wie hier beschrieben, ergibt die Zugabe von 2,1–2,3 µL der Beweglichkeitsmischung eine Kammerhöhe von etwa 4,3 µm, wodurch 2,0-µm-Kügelchen stabil positioniert werden, ohne übermäßiges Driften oder Kompression aufzuweisen.&#160;Wenn ein Deckglas einer anderen Größe verwendet wird, sollte das Proben­volumen entsprechend angepasst werden, um eine gleichmäßige Füllung der Kammer, stabile Positionierung der Kügelchen und minimales Probendriften zu gewährleisten.
Wenn Kometenschweife nicht entstehen, überprüfen Sie die Fähigkeit zur Aktinpolymerisation und die Aktivität der NPF. Wenn die Symmetriebrechung nicht auftritt, passen Sie die CP-Konzentration an, um die Netzwerkdichte zu modulieren. Zu dichte Netzwerke widerstehen einer Zerbrechung, während zu schwach ausgeprägte Netzwerke an struktureller Integrität mangeln. Wenn myosinbeschichtete Kügelchen keinen Unterschied zu Kontrollkügelchen zeigen, bestätigen Sie die Myosin-Oberflächendichte und die Motoraktivität. Zur Qualitätskontrolle ist das Akzeptanzkriterium funktional und basiert nicht auf einer absoluten numerischen Grenze. Eine neue Aufbereitung gilt als akzeptabel, wenn&#160;sie die Bildung und das Wachstum von Kometenschwänzen reproduziert, wie sie mit einer zuvor validierten Aufbereitung beobachtet wurden (wie in&#160;Abbildung 3 gezeigt). Zusätzlich sollte jede neue Aufbereitung von Myosin, Arp2/3-Komplex, NPF, CapZ oder Aktin mittels der geeigneten Qualitätskontroll-Assays bewertet und vor der Verwendung mit einer zuvor validierten Aufbereitung verglichen werden, um Konsistenz in quantitativen Experimenten sicherzustellen (siehe Protokollabschnitt 3.1).
Bei der Interpretation der Ergebnisse sollten mehrere Einschränkungen dieses Assays berücksichtigt werden. Erstens wird die Fluoreszenzintensität als relativer, nicht kalibrierter Ersatzparameter für die Aktin-Netzwerkdichte verwendet; daher sollten Vergleiche nur zwischen Proben durchgeführt werden, die unter identischen Aufnahmebedingungen abgebildet und mit demselben Schwellenwertverfahren analysiert wurden. Zweitens liefern die Beweglichkeit der Kügelchen, das Wachstum der Kometenschwänze und die Wachstumseffizienz indirekte Messgrößen für das kraftgenerierende Verhalten des Netzwerks, stellen jedoch keine direkten Kraftmessungen dar. Um die vom Netzwerk erzeugten Kräfte zu quantifizieren, sind direkte mechanische Messungen erforderlich, wie beispielsweise optisches Fangen oder kraftkalibrierte Membranverformungsassays64,65. Drittens ermöglicht dieser Assay keine direkte Auflösung der Feinstruktur des Aktin-Netzwerks, z. B. Filamentorientierung, Verzweigungsdichte oder lokale Myosin-Organisation.&#160;Zur Charakterisierung der nanoskaligen Struktur&#160;könnten ergänzende Methoden wie die Elektronenmikroskopie oder die Super-Auflösungs-Bildgebung erforderlich sein. Schließlich bietet die Verwendung starrer, mikrometergroßer Kügelchen eine vereinfachte und experimentell handhabbare Schnittstelle, erfasst aber nicht die Verformbarkeit, Krümmungsheterogenität, Lipidmobilität oder molekulare Komplexität zellulärer Membranen. Die zukünftige Entwicklung physiologisch relevanterer Schnittstellen wird daher wichtig sein, um zu untersuchen, wie zytoskelettale Komponenten an der Zellvorderkante koordiniert werden.
Insgesamt bietet dieser Rekonstitutionsansatz eine präzise Kontrolle über die Proteinzusammensetzung und -konzentration und ermöglicht es, einzelne Komponenten mechanistisch zu untersuchen, was in zellulären Systemen nur schwer zu erreichen ist. Er stellt eine vielseitige Plattform dar, um zu erforschen, wie molekulare Motoren verzweigte Aktinnetzwerke umgestalten und die Kraftentfaltung an membranähnlichen Grenzflächen beeinflussen. Bei entsprechender Validierung kann der Assay erweitert werden, um zu untersuchen, wie verschiedene Myosinklassen, mutierte oder krankheitsassoziierte Motorenvarianten sowie kraftsensitive Aktin-bindende Proteine die mechanische Rückkopplung in dynamischen Aktinnetzwerken regulieren. Allgemeiner hilft dieses System dabei, molekulare Motoraktivität mit der mesoskaligen Zytoskelettsorganisation und mechanischen Funktion zu verknüpfen, mit Auswirkungen auf Zellmotilität, Endozytose und Membranumgestaltung.

Die durch den Aktin-ähnlichen Protein-2/3-(Arp2/3-)Komplex vermittelte verzweigte Aktinpolymerisation erzeugt die primären vorantreibenden Kräfte, die eine Vielzahl zellulärer Prozesse antreiben, darunter Zellmotilität, Endozytose, Phagozytose und die Bildung von Zelladhärenzkomplexen1,2,3,4,5,6. An der führenden Kante wandernder Zellen aktivieren Nukleationsfördernde Faktoren (NPFs) den Arp2/3-Komplex an der Plasmamembran und initiieren so die Assembly dendritischer Aktinnetzwerke, die die Membran vorwärts schieben. Myosin-I-Motoren kolokalisieren häufig mit diesen verzweigten Aktinnetzwerken an Membrangrenzflächen und sind in die Regulierung&#160;der Aktinorganisation&#160;sowie die Modulation der Kraftentfaltung eingebunden7,8,9,10,11,12,13. Trotz zunehmender Hinweise darauf, dass Myosin-I an aktinabhängigen mechanischen Prozessen beteiligt ist, sind die molekularen Mechanismen, durch die Myosin-I mit der Arp2/3-vermittelten verzweigten Aktinassembly interagiert, um die Netzwerkarchitektur und mechanische Leistung zu modulieren, weiterhin unzureichend verstanden.
Um diese Lücke zu schließen, integrierten wir Myosin-I in das etablierte Aktin-Komet-Schwanz-Perlen-Beweglichkeits-System14,15,16,17, um die Wechselwirkungen zwischen Myosin-I, Aktin und dem Arp2/3-Komplex auf der Oberfläche von mikrometergroßen Perlen neu zu rekonstituieren. Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, quantitativ zu untersuchen, wie die Kopplung von Myosin und Aktin die verzweigte Aktin-Assembly, die Netzwerkarchitektur, das Brechen der Symmetrie und die Perlenbeweglichkeit an einer membranähnlichen Grenzfläche beeinflusst. In diesem Test werden Myosin-I und NPFs gemeinsam auf mikroskaligen Perlen beschichtet, um ihre Kolokalisation an der Plasmamembran zu imitieren18. Nach Einleitung der Polymerisation stimulieren an der Oberfläche gebundene NPFs die Arp2/3-abhängige, verzweigte Aktin-Assembly, was zur Bildung einer Aktinschale, zum Brechen der Symmetrie und zur Entwicklung eines polarisierten Kometenschwanzes&#160;führt, der die Perlenpropulsion antreibt14,19,20,21,22,23. Durch systematische Variation der Myosin-Oberflächendichte18 und gezielte Modulation der Aktinnetzwerkdichte über die Konzentration des Capping-Proteins (CP)15,19,24 ermöglicht diese Methode eine quantitative Analyse der Aktin-Assembly-Kinetik, Wachstumseffizienz, Netzwerkarchitektur und Perlenbeweglichkeit und liefert indirekte Messgrößen, die mit myosin-I-abhängigen Veränderungen der mechanischen Leistung assoziiert sind.
Der Assay bietet zudem deutliche Vorteile gegenüber komplementären Ansätzen. Im Vergleich zu Bulk-Polymerisationsassays, wie beispielsweise Pyren-Aktin-Assays, ermöglicht dieses Kugelbeweglichkeits-System die direkte Visualisierung der verzweigten Aktin-Assembly sowie der durch Aktinpolymerisation angetriebenen Bewegung der Kugeln. Im Gegensatz zu zellulären Studien, bei denen überlappende Proteinfunktionen und komplexe zelluläre Umgebungen individuelle Beiträge verschleiern und die Interpretation erschweren können, bietet dieser Assay präzise Kontrolle über die Proteinzusammensetzung, -konzentration und -anordnung an der Oberfläche und ermöglicht somit eine systematische Untersuchung, wie Myosin-I unter definierten biochemischen Bedingungen mit der Arp2/3-vermittelten Aktin-Assembly interagiert.
Diese Methode eignet sich am besten dafür, zu untersuchen, wie zytoskelettale Bestandteile an einer membranähnlichen&#160;Grenzfläche koordiniert werden, um die Architektur des Aktinnetzwerks und die mechanische Leistung zu regulieren. Obwohl das vorliegende Protokoll für die myosin-I-vermittelte verzweigte Aktin-Assembly optimiert ist, könnte sein modulares Design in Zukunft angepasst werden, um andere membranassoziierte Myosin-Klassen (z. B. Myosin VI, VII, X, XV und XIX) und/oder Aktin-bindende Proteine (z. B. Formine, vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein (VASP), Cortactin, Coronin oder Tropomyosin) zu untersuchen. Solche Anpassungen würden eine Validierung der Proteinimmobilisierung, Aktivität und Oberflächendichte erfordern. Außerdem ist das Assay für Puls-Chase-Markierungsstrategien geeignet. Die Einbindung von photokonvertierbarem oder photoaktivierbarem Aktin oder markierten Arp2/3-Untereinheiten könnte die Messung der Filamentumwandlungs- und Verzweigungsdissociationsraten innerhalb des wachsenden Netzwerks ermöglichen25. Insgesamt bietet dieses Assay eine vielseitige Plattform, um das molekulare Zusammenspiel zwischen membranassoziierten Motoren, Aktinfilamenten und Aktin-bindenden Proteinen zu untersuchen sowie zu erforschen, wie Motoren und Aktin-bindende Proteine die Umgestaltung des Netzwerks und die Kraftentwicklung an membranähnlichen Grenzflächen regulieren14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Allgemeiner dient es zudem als minimale, justierbare Plattform aus aktiver Materie, um die physikalischen Prinzipien motorgetriebener Nichtgleichgewichtsdynamiken zu untersuchen, wie z. B. Symmetriebrechung, Selbstorganisation, mechanochemische Rückkopplung und andere emergente Verhaltensweisen in aktiven Aktomyosin-Netzwerken18,19,20,21,22,23,35,36, mit möglicher Relevanz für die Physik aktiver Materie und die Werkstofftechnik.

<table><tbody><tr><td>Adenosin-5&amp;prime;-triphosphat-Natriumsalz-Hydrat</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>Wird zur Herstellung von ATP-haltigen Puffern verwendet; Aliquoten herstellen und bei &amp;minus;20&amp;deg;C lagern.</td></tr><tr><td>Arp2/3-Komplex</td><td>Eigenlabor</td><td>N/V</td><td>Wird zur Keimbildung verzweigter Aktinnetzwerke verwendet; gemäß Referenz 42 gereinigt.</td></tr><tr><td>Biotin-CF640-Fluoreszenzfarbstoff</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>Wird zur fluoreszenzmarkierten Markierung von Kontrollkügelchen verwendet; vor Licht schützen und bei &amp;minus;80&amp;deg;C lagern.</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Myo1d</td><td>Eigenlabor</td><td>N/V</td><td>Motorprotein, das zum Beschichten myosinbeschichteter Kügelchen verwendet wird; hergestellt gemäß den Angaben in den Referenzen 18 und 38&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Wird für Blockier- und Lagerungspuffer für Kügelchen verwendet; gefilterte Stammlösung herstellen.</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Pufferbestandteil, der im X-Puffer und bei Calcium-Störungsversuchen verwendet wird.</td></tr><tr><td>Calmodulin</td><td>Eigenlabor</td><td>N/V</td><td>Wird myosinhaltigen Reaktionen und dem Lagerungspuffer für Kügelchen zugesetzt; gemäß Referenz 44 gereinigt.</td></tr><tr><td>Carboxylat-Polystyrolkügelchen (2,0 &amp;micro;m Durchmesser)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>Wird als feste Trägerphase für NPF, NeutrAvidin, Fluoreszenzfarbstoff und Myosinbeschichtung verwendet; bei 4&amp;deg;C lagern.</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>Wird zur Aufnahme von Fluoreszenzbildern während der Zeitraffermikroskopie verwendet.</td></tr><tr><td>Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>Wird zum Anfärben von SDS-PAGE-Gelen vor der dichtometrischen Analyse verwendet.</td></tr><tr><td>Deckgläser, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1,5</td><td>Globe</td><td>1404-15</td><td>Wird zusammen mit Objektträgern zur Montage von Druckkammern verwendet.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>Reduktionsmittel, das in Puffern und Beweglichkeitsmischungen verwendet wird; bei &amp;minus;20&amp;deg;C lagern.</td></tr><tr><td>Trockenscroll-Vakuumpumpe</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>Wird zum Betrieb des Plasma-Reinigungssystems verwendet.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>Calciumchelator, der im M-Puffer, Beweglichkeitspuffer und bei der Aktin-Vorbehandlung verwendet wird.</td></tr><tr><td>Externe Lichtquelle</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Metalldampf-Halogenid-Lichtquelle für die Fluoreszenzmikroskopie.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Open Source</td><td>N/V</td><td>Wird zur Analyse der Länge von Kometenschwänzen, der Fluoreszenzintensität und der Netzwerkdichte verwendet (Version 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>Invertiertes Epifluoreszenzmikroskop zur Abbildung von Aktin-Kometenschwänzen.</td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>Bestandteil der Entfärbungslösung für SDS-PAGE-Gele; ätzend, entsprechende Sicherheitsvorkehrungen beachten.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03-A</td><td>Nukleationsfördernder Faktor, der für die Arp2/3-vermittelte Aktin-Assembly verwendet wird; Aliquoten herstellen und bei &amp;minus;80&amp;deg;C lagern.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>Pufferreagenz, das im X-Puffer, M-Puffer und Beweglichkeitspuffer verwendet wird.</td></tr><tr><td>Menschliches CapZ</td><td>Eigenlabor</td><td>N/V</td><td>Abdeckprotein, das zur Regulierung der Aktinnetzwerkdichte verwendet wird; gemäß Referenz 43 gereinigt.</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>Pufferbestandteil, der in Reaktionspuffern und bei der Aktin-Vorbehandlung verwendet wird.</td></tr><tr><td>MetaMorph-Bildverarbeitungssoftware</td><td>Molecular Devices</td><td>N/V</td><td>Wird zur Mikroskopsteuerung und Bildaufnahme verwendet (Version 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>Bestandteil der Entfärbungslösung für SDS-PAGE-Gele; entzündlich, gemäß den Sicherheitsvorschriften der Institution handhaben.</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>Wird dem Beweglichkeitspuffer zugesetzt, um die Viskosität der Lösung zu erhöhen (1500 cP).</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>Wird zur Montage von Druckkammern für die Mikroskopie verwendet.</td></tr><tr><td>NeutrAvidin-Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Wird zur Immobilisierung biotinylierter Proteine auf der Oberfläche von Kügelchen verwendet; Aliquoten herstellen und bei &amp;minus;80&amp;deg;C lagern.</td></tr><tr><td>PageRuler Plus prägefärbte Proteinleiter</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>Molekulargewichtsmarker für die SDS-PAGE-Analyse; bei &amp;minus;20&amp;deg;C lagern.</td></tr><tr><td>Plasma-Reiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Wird zum Plasma-Reinigen von Objektträgern und Deckgläsern vor der Kammermontage verwendet.</td></tr><tr><td>Polyethersulfon-Spritzenfilter, 0,22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>Wird zum Filtrieren der Stammlösung von Rinderserumalbumin vor der Aliquotierung verwendet.</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>Salz, das zur Aufrechterhaltung der Ionenstärke in Testpuffern verwendet wird.</td></tr><tr><td>Skelettmuskelaktin aus Kaninchen</td><td>Eigenlabor</td><td>N/V</td><td>Gemäß Referenz 41 gereinigt und als G-Aktin für Aktin-Kometenschweif-Assembly-Assays verwendet.</td></tr><tr><td>Kühlmikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>Wird zum Pelletieren der Kügelchen während der Kügelchenvorbereitung und Waschschritte verwendet.</td></tr><tr><td>Drehrohrmischer (Laborrotator)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>Wird während der Inkubationsschritte zur Kügelchenbeschichtung verwendet, um die Kügelchensuspension aufrechtzuerhalten.</td></tr><tr><td>Tris/Glycin/SDS-Laufpuffer (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>Vor der SDS-PAGE-Elektrophorese auf 1&amp;times; verdünnen.</td></tr><tr><td>Vakuumfett</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>Wird zum Abdichten von Druckkammern vor der Fluoreszenzbildgebung verwendet.</td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;20% Gradienten-SDS-Polyacrylamidgel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Wird für die SDS-PAGE-Analyse von an Kügelchen gebundenen Proteinen verwendet; bei 4&amp;deg;C lagern.</td></tr></tbody></table>

rekonstitution der myosin-i-vermittelten verzweigten aktin-assemblierung in einem bead-basierten assay zur motilität von aktin-kometenschweifen

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

Die durch den Aktin-verwandten Protein-2/3-(Arp2/3-)Komplex vermittelte verzweigte Aktinpolymerisation liefert die primären Vorwärtskräfte für eine Vielzahl zellulärer Prozesse, darunter Zellmigration, Endozytose und Phagozytose. Myosin-I-Motoren, die häufig gemeinsam mit verzweigten Aktinnetzwerken an der Zellvorderkante auftreten, sind ebenfalls an diesen Prozessen beteiligt und sollen die Organisation und mechanische Leistung der Aktinnetzwerke regulieren. Die molekularen Mechanismen, durch die Myosin-I mit dem Arp2/3-Komplex interagiert, um die verzweigte Aktinpolymerisation und Kraftentfaltung zu modulieren, sind jedoch weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir einen hochgradig einstellbaren in vitro-Aktin-Komet-Schwanz-Beweglichkeitsassay, der das Zusammenspiel zwischen Myosin-I, Aktin und dem Arp2/3-Komplex an der Zellvorderkante auf der Oberfläche mikrometergroßer Kügelchen rekonstituiert. Diese Methode leitet sich von etablierten Aktin-Komet-Schwanz-Assays ab und immobilisiert Myosin-I gemeinsam mit nukleationsfördernden Faktoren (NPFs) auf der Oberfläche der Kügelchen, wodurch eine membranähnliche Aktinpolymerisationsgrenzfläche entsteht. Der Assay ermöglicht die Visualisierung und quantitative Analyse der Aktinnetzwerkformation, Netzwerkdichte, Kügelchenbeweglichkeit und Wachstumseffizienz. Er liefert zudem indirekte, qualitative Hinweise auf die durch Myosin-I vermittelte Kraftverstärkung in verzweigten Aktinnetzwerken. Dieses Protokoll umfasst die Funktionalisierung der Kügelchen, die Reaktionszubereitung, Fluoreszenzbildgebung, quantitative Bildanalyse sowie Strategien zur Fehlerbehebung und bietet damit eine reproduzierbare Plattform zur Untersuchung der Myosin-I-regulierten Aktinpolymerisation an membranähnlichen Grenzflächen.

Der Aktin-Komet-Schwanz-Beweglichkeits-Assay wurde verwendet, um den Einfluss der Myosin-I-Aktivität auf die Arp2/3-Komplex-vermittelte verzweigte Aktin-Assembly an der Zellvorderkante zu untersuchen, wobei Szenarien nachgebildet wurden, in denen membranassoziiertes Myosin-I mit der Aktinpolymerisation koordiniert, um die Membranausstülpung voranzutreiben7,8,9,10,11,12,13. Um die Kolokalisation von Myosin-I und NPFs an der Membran-Aktin-Grenzfläche nachzuahmen, wurden beide Proteine gemeinsam auf die Oberfläche mikroskaliger Kügelchen aufgebracht, wodurch ihre räumliche Nähe in einem kontrollierten in vitro-System rekonstituiert wurde (Abbildung 1A,B).
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
Abbildung 1. Rekonstitution der Myosin-I-vermittelten verzweigten Aktin-Assembly auf mikroskaligen Kügelchen. (A) Schematische Darstellung der Wechselwirkungen zwischen Myosin-I, Nukleationsförderungsfaktoren (NPFs), dem Aktin-verwandten Protein 2/3 (Arp2/3)-Komplex, Kappprotein (CP) und globulärem Aktin (G-Aktin) an der vorderen Zellkante. (B) Schematische Darstellung der Funktionalisierung der Kügelchen. Kontrollkügelchen und myosinbeschichtete Kügelchen wurden mit NPF und Neutravidin beschichtet. Neutravidin war entweder mit biotinyliertem farbfernem rotem Fluoreszenzfarbstoff für Kontrollkügelchen oder mit biotinyliertem Drosophila Myo1d für myosinbeschichtete Kügelchen konjugiert. (C) Repräsentative Zeitreihe, die das Wachstum von Aktin-Kometenschwänzen von der Symmetriebrechung bis zur polarisierten Kometenschwanzbildung für ein Kontrollkügelchen und ein myosinbeschichtetes Kügelchen zeigt. Das letzte Panel zeigt beide Kügelchen im selben Sichtfeld. Maßstabsbalken: 5 µm. Die Panels B und C sind aus Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, mit Genehmigung übernommen/geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Um den spezifischen Beitrag von Myosin-I zur Aktin-Assembly besser beurteilen zu können, wurde ebenfalls eine entsprechende Kontrollperle hergestellt. Die Kontrollperlen waren identisch mit den Myosin-beschichteten Perlen, mit dem Unterschied, dass Myosin-I durch einen biotinylierten, rot-fluoreszierenden Farbstoff ersetzt wurde, der an Neutravidin gekoppelt war (Abbildung 1B). Durch die Vermischung beider Perlenarten in derselben Reaktionskammer und deren Abbildung im selben Sichtfeld war ein direkter Vergleich der verzweigten Aktin-Assembly in Gegenwart und Abwesenheit von Myosin-I unter identischen experimentellen Bedingungen möglich (Abbildung 1C). Darüber hinaus konnte durch Variation des Verhältnisses von Myosin zu NPF auf der Oberfläche der Perle der Einfluss von Myosin-I bei unterschiedlichen Oberflächendichten systematisch untersucht werden (Abbildung 2A,B). Zusätzlich ließ sich die Dichte des Aktin-Netzwerks durch Anpassung der Konzentration von CP einstellen, wodurch Netzwerke von dicht gepackten, widerstandsfähigen Strukturen bis hin zu locker organisierten, bruchanfälligen Architekturen erzeugt werden konnten15,19,24. Dieser Ansatz ermöglichte die Untersuchung, wie Myosin-I die verzweigte Aktin-Assembly in Netzwerken unterschiedlicher Dichte und struktureller Integrität beeinflusst (Abbildung 2A,B).
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
Abbildung 2. Aktin-Komet-Schweif-Morphologie&#160;bei verschiedenen Myosin-Oberflächendichten und Kappprotein-Konzentrationen. (A) Repräsentative Fluoreszenzbilder von 2 µm durchmessenden Kügelchen, beschichtet mit unterschiedlichen Myosin-Oberflächendichten und in Reaktionen assembliert, die 30–200 nM Kappprotein (CP), 4 µM Aktin mit 5 % Rhodamin-markiertem Aktin sowie 200 nM Arp2/3&#160;-Komplex enthielten. Für jede Bedingung wurden Kontrollkügelchen und Myosin-beschichtete Kügelchen im selben Sichtfeld abgebildet. Die Myosin- und Nukleationsfördernde-Faktor-(NPF)-Oberflächendichten wurden mittels Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt, wie in Schritt 2.3 beschrieben. Die Aufnahmen erfolgten 20–35 Minuten nach Reaktionsbeginn. Helligkeit und Kontrast wurden linear und identisch innerhalb jedes Kontroll–Myosin-Kügelchen-Paares angepasst, jedoch zwischen den Bedingungen unabhängig skaliert, um eine bessere Visualisierung zu ermöglichen. Maßstab: 5 µm. (B) Qualitative Übersichtsdarstellung des Assays, die die Komet-Schweif-Ergebnisse über verschiedene CP-Konzentrationen und Myosin-Oberflächendichten zusammenfasst. Jeder Datenpunkt repräsentiert ein gepaartes Kontroll–Myosin-Kügelchen unter der angegebenen Bedingung. Die Symbole zeigen die beobachteten Ergebnisse an, einschließlich Myosin-beschichteter Kügelchen, die Symmetriebrechung, längere Schweife, ähnliche Schweife, kürzere Schweife, keine Komet-Schweif-Bildung oder sternähnliche Strukturen hervorrufen. Die Daten wurden aus mehr als 20 unabhängigen Experimenten gesammelt, wobei für jede Bedingung mehr als 10 Kügelchenpaare analysiert wurden. Diese Abbildung ist reproduziert/geändert aus Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, mit Genehmigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Nach dem Mischen der Testkomponenten stimulierte das an der Oberfläche gebundene NPF den Arp2/3-Komplex-vermittelten, verzweigten Aktin-Aufbau um die Beadoberfläche herum. Bei einer typischen, erfolgreichen Reaktion erschien Aktin zunächst als dünne Hülle, die den Bead umgab. Während die Polymerisation fortschritt, dehnte sich die Hülle aus und das Netzwerk wurde dichter verwoben. Die fortgesetzte Aktin-Assembly an der Beadoberfläche führte zu einem nach außen gerichteten Netzwerkwachstum, was zur Symmetriebrechung und zur Bildung eines polarisierten Kometenschweifs führen konnte. Sobald ein Kometenschweif entstanden war, ermöglichte die andauernde Aktin-Nukleation und -Polymerisation an der Beadoberfläche eine anhaltende Bewegung des Beads (Abbildung 1C). Diese aufeinanderfolgenden Merkmale – Bildung der Aktinhülle, Symmetriebrechung, Verlängerung des Kometenschweifs und Bead-Propulsion – dienten als visuelle Indikatoren dafür, dass der Test ordnungsgemäß funktionierte.
Wie in unserer ursprünglichen Studie berichtet18 und in Abbildung 2A,B veranschaulicht, war die Kometenschweif-Morphologie sowohl gegenüber der CP-Konzentration als auch gegenüber der Myosin-Oberflächendichte empfindlich. Unter Standardtestbedingungen (200 nM Arp2/3-Komplex, 50 nM CP, Myosin:NPF-Verhältnis = 0,43:1) erzeugten mit Myosin beschichtete Kügelchen typischerweise spärlichere oder diffusere Aktin-Kometenschweife als Kontrollkügelchen (Abbildung 2A). Bei niedrigen CP-Konzentrationen (&#60;30 nM) assemblierte sich Aktin zu dichten, bruchfesten Hüllen. Unter diesen Bedingungen blieben Kontrollkügelchen oft eingeschlossen und durchbrachen die Symmetrie nicht, während mit Myosin beschichtete Kügelchen eher in der Lage waren, die Symmetrie zu durchbrechen und aus der umgebenden Aktinhülle zu entkommen (Abbildung 2A,B). Bei hohen CP-Konzentrationen (&#62;200 nM) war die Netzwerk-Kohäsion verringert, und das Vorhandensein von Myosin destabilisierte das Aktin-Netzwerk weiter, förderte das Abstoßen von Aktin und verhinderte die Bildung stabiler Kometenschweife (Abbildung 2A,B). Diese bedingungsabhängigen Ergebnisse liefern nützliche Referenzpunkte, die Forschende nutzen können, um geeignete Testbedingungen zu identifizieren und Probleme bei der Testdurchführung zu beheben.
Der Einfluss von Myosin-I auf die Morphologie von Aktin-Kometenschwänzen kann durch die Messung der mittleren Fluoreszenzintensität des Kometenschwanzes beurteilt werden. Der Bereich des Kometenschwanzes wurde mithilfe einer Intensitätsschwelle definiert, wie in Schritt 4.2 beschrieben, und anschließend die mittlere Fluoreszenzintensität innerhalb dieses Bereichs gemessen (Abbildung 3A). Bei vergleichbaren Aufnahmebedingungen, bei denen Kontroll- und Myosin-beschichtete Kügelchen im selben Sichtfeld abgebildet wurden, diente dieser Wert als relativer, nicht kalibrierter Indikator für die Dichte des Aktinnetzwerks, wobei eine geringere mittlere Intensität auf ein dünneres Netzwerk hindeutet. Unter Standardtestbedingungen erzeugten Myosin-beschichtete Kügelchen typischerweise Kometenschwänze mit geringerer mittlerer Fluoreszenzintensität als Kontrollkügelchen, was einer verringerten scheinbaren Netzwerkdichte entspricht (Abbildung 3C).
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
Abbildung 3. Quantifizierungsworkflow für die Kinetik des Wachstums und die Assemblierungseffizienz von Aktin-Kometenschwänzen. (A) Repräsentative Zeitreihe des Wachstums von Kometenschwänzen an einem Kontrollkügelchen und einem mit Myosin im Verhältnis 0,43:1 beschichteten Kügelchen in Gegenwart von 50 nM Capping-Protein (CP). Schwarze Umrisse zeigen die als Regionen von Interesse (ROIs) identifizierten Kometenschwanzbereiche an, die mit Fiji zur Messung der Fluoreszenzintensität bestimmt wurden. Reaktionsbedingungen: 4 µM Aktin mit 5 % Rhodamin-markiertem Aktin, 200 nM Aktin-verwandtes Protein 2/3 (Arp2/3)-Komplex und 50 nM CP. Maßstab, 5 µm. (B) Kometenschwanzzänge in Abhängigkeit von der Zeit für das repräsentative Paar aus Kontroll- und Myosin-Kügelchen, dargestellt in Feld (A). Der Ausschnitt zeigt das Zeitfenster, das zur linearen Anpassung verwendet wurde; die Wachstumsraten der Schwänze wurden aus den Steigungen der angepassten Geraden ermittelt. (C) Normalisierte gesamte Fluoreszenzintensität des Kometenschwanzes in Abhängigkeit von der Zeit für das repräsentative Paar aus Kontroll- und Myosin-Kügelchen, dargestellt in Feld (A). Kontroll- und Myosin-Kügelchen wurden auf die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Kontrollkügelchen zwischen 1100 und 1300 s normalisiert. Der Ausschnitt zeigt das Zeitfenster, das zur linearen Anpassung verwendet wurde; die Raten der Fluoreszenzassemblierung wurden aus den Steigungen der angepassten Geraden berechnet. (D) Zusammenfassungstabelle mit den Werten für die Schwanzwachstumsrate, die Fluoreszenzassemblierungsrate und die Wachstumseffizienz für das repräsentative Paar aus Kontroll- und Myosin-Kügelchen, dargestellt in Feld (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Der Einfluss von Myosin-I auf die Wachstumsdynamik von Kometenschwänzen kann durch die zeitabhängige Messung der Verlängerung des Kometenschwanzes und der Akkumulation der Aktinfluoreszenz quantifiziert werden. In den meisten Experimenten wuchsen die Kometenschwänze während der ersten ~10 Minuten nach der Symmetriebrechung mit annähernd konstanter Geschwindigkeit. Mit der fortschreitenden Erschöpfung der Polymerisationskomponenten verlangsamte sich das Wachstum zunehmend und stoppte typischerweise etwa 30 Minuten nach Reaktionsbeginn. Zur Quantifizierung der Wachstumsdynamik wurden die Länge des Kometenschwanzes und die gesamte Fluoreszenzintensität über die Zeit aufgetragen (Abbildung 3B,C). Die ersten 7–10 Datenpunkte, die der anfänglichen linearen Phase entsprechen, wurden mittels linearer Regression angepasst (Abbildung 3B,C, Einlagen). Die Steigungen dieser Anpassungen repräsentierten die anfängliche Schwanzwachstumsrate bzw. die Aktinfluoreszenz-Antwachstumsrate. Die Wachstumseffizienz wurde definiert als die Schwanzwachstumsrate geteilt durch die Aktinfluoreszenz-Antwachstumsrate und quantifiziert, wie effektiv die Aktinpolymerisation in produktive Kugelverschiebung umgesetzt wurde (Abbildung 3D). In dem repräsentativen Beispiel in Abbildung 3A–D zeigte die mit Myosin beschichtete Kugel eine Schwanzwachstumsrate von 0,60 µm/min (0,010 µm/s) im Vergleich zu 0,57 µm/min (0,0095 µm/s) für die Kontrollkugel (Abbildung 3B,D). Die entsprechenden Wachstumseffizienzen betrugen 5,6 bzw. 4,5 µm/Intensitätseinheit und stellen einen etwa 1,2-fach höheren Wert für die mit Myosin beschichtete Kugel dar (Abbildung 3D). Unter Standardbedingungen zeigten mit Myosin beschichtete Kugeln typischerweise Wachstumsraten, die denen der Kontrollkugeln vergleichbar waren (Myosin: 0,69 ± 0,10 µm/min; Kontrolle: 0,66 ± 0,20 µm/min), verbunden mit einer niedrigeren Aktinfluoreszenz-Antwachstumsrate (ca. 0,76-fach der Kontrolle) und einer etwa 1,4-fach höheren Wachstumseffizienz, wie bereits in unserer ursprünglichen Studie berichtet18. Diese Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung von 11 Kugelpaaren pro Bedingung aus fünf unabhängigen Experimenten angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mittels zweiseitigem gepaartem t-Test, wie in der ursprünglichen Studie beschrieben18.
Um den Beitrag des Myosin-Kraftschlags zu bewerten und die Möglichkeit auszuschließen, dass die beobachteten Effekte auf sterische Behinderung aufgrund der Besetzung der Oberfläche mit Myosin zurückzuführen sind, kann der Kugel-Motilitäts-Assay unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Kraftschlag-Aktivität von Myosin-I stören. In diesem Protokoll wurde die motorische Aktivität von Myosin-I durch Zugabe von 1,1 mM Ca2+ zur Reaktionsmischung gehemmt. Erhöhte Ca2+-Konzentrationen förderten die Dissoziation von Calmodulin vom Hebelarm des Myosin-I, wodurch die Steifigkeit des Hebelarms verringert und die Kraftentwicklung beeinträchtigt wurde46,47,48. Unter diesen Bedingungen blieb Myosin-I dynamisch an Aktin gebunden, unterstützte jedoch kein Aktin-Gleiten (Abbildung 4A,B), was eine nützliche Kontrolle zur Beurteilung abhängiger Effekte der motorischen Aktivität darstellt18.
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
Abbildung 4. Kalziumbasierte Kontrolle zur Beurteilung der Myo1d-Motoraktivität im Kugelbeweglichkeitsassay. (A) Zeitkollabierte Bilder von Aktinfilamenten, die sich auf einer mit Myo1d beschichteten Oberfläche in Abwesenheit erhöhter Kalziumkonzentration bewegen oder in Gegenwart von 100 µM freiem Kalzium nichtproduktive Wirbelmuster bilden. Die farbige Regenbogenleiste zeigt den zeitlichen Verlauf über 61 Aufnahmen im Abstand von jeweils 5 s an. Maßstabsbalken: 5 µm. (B) Quantifizierung der Aktin-Gleitgeschwindigkeit in Abwesenheit und Gegenwart von 100 µM freiem Kalzium (N = 2 unabhängige Experimente; n = 25 Filamente). Unter diesen Bedingungen wurde in Gegenwart von 100 µM freiem Kalzium kein produktives Gleiten der Aktinfilamente beobachtet. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. (C) Repräsentative Kontroll- und Myosin-beschichtete Kugelpaare, die in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 µM freiem Kalzium hergestellt wurden. Für jede Bedingung sind fünf repräsentative Kugelpaare dargestellt. Innerhalb jedes Paares wurden die Kontrollkugel und die Myosin-beschichtete Kugel im selben Sichtfeld abgebildet. Die Aufnahmen erfolgten etwa 15–20 Minuten nach Initiierung der Reaktion. Helligkeit und Kontrast wurden linear und identisch innerhalb jedes Kontroll–Myosin-Kugelpaares angepasst, jedoch zwischen den Bedingungen unabhängig skaliert. Reaktionsbedingungen: 4 µM Aktin mit 5 % Rhodamin-markiertem Aktin, 200 nM Aktin-verwandter Protein-2/3-(Arp2/3-)Komplex und 50 nM Capping-Protein (CP). Maßstabsbalken: 5 µm. Die Panels A und B sind reproduziert/geändert aus Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, mit Genehmigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Wenn der Test korrekt durchgeführt wurde, bildeten Myosin-beschichtete Kügelchen unter erhöhten Ca2+-Bedingungen kürzere Aktin-Kometenschwänze mit Netzwerkdichten, die denen von Kontrollkügelchen vergleichbar waren (Abbildung 4C). Fünf repräsentative Paare aus Kontroll- und Myosin-beschichteten Kügelchen aus zwei unabhängigen Experimenten sind dargestellt. Dieses qualitative Ergebnis wurde konsistent bei wiederholten Testdurchführungen beobachtet und wird durch die quantitative Analyse der ursprünglichen Studie gestützt18. Dieses erwartete Ergebnis weist darauf hin, dass die unter Standardbedingungen beobachteten Netzwerkunterschiede auf einem aktiven Myosin-Kraftschlag beruhen und nicht allein auf der Besetzung der Oberfläche mit Myosin. Daher dient die Bedingung mit erhöhtem Ca2+ als wichtige Kontrolle, um zu beurteilen, ob Veränderungen in der Organisation des verzweigten Aktinnetzwerks auf die Aktivität des Myosin-Motors zurückzuführen sind.

Dieses Protokoll beschreibt einen justierbaren Aktin-Kometenschweif-Bead-Beweglichkeitsassay zur quantitativen Untersuchung, wie die Myosin-Motoraktivität die verzweigte Aktin-Assembly und die Netzwerkarchitektur an einer membranähnlichen Grenzfläche beeinflusst.

Rekonstitution der Myosin-I-vermittelten verzweigten Aktin-Assemblierung in einem Bead-basierten Assay zur Motilität von Aktin-Kometenschweifen

Die durch den actin-related protein 2/3 (Arp2/3)-Komplex vermittelte verzweigte Aktinpolymerisation liefert die primären Schubkräfte für eine Vielzahl zellulärer ...

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

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Rekonstitution der Myosin-I-vermittelten verzweigten Aktin-Assemblierung in einem Bead-basierten Assay zur Motilität von Aktin-Kometenschweifen

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