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Diese Arbeit wurde durch die Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011278), das selbst finanzierte Projekt des Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (GDBRI-ZL202602) und den chinesisch-kanadischen akademischen Austausch und die Zusammenarbeit zu kardiovaskulären Krankheitsmodellen und Pathogenese (MS202500058) unterstützt.

<ol>
	<li>Fauconnier, J., Meli, A. C., Thireau, J., Roberge, S., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+leak+mediated+by+caspase-8+activation+leads+to+left+ventricular+injury+after+myocardial+ischemia-reperfusion.">Ryanodine receptor leak mediated by caspase-8 activation leads to left ventricular injury after myocardial ischemia-reperfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13258-13263 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+a+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J Am Coll Cardiol. , (2000).</li><li>Liu, D., Tian, X., Liu, Y., Song, H., Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREG+ameliorates+the+phenotypic+switching+of+cardiac+fibroblasts+after+myocardial+infarction+via+modulation+of+CDC42.">CREG ameliorates the phenotypic switching of cardiac fibroblasts after myocardial infarction via modulation of CDC42.</a> Cell Death Dis. 12 (4), (2021).</li><li>Contessotto, P., Pandit, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+to+prevent+post-infarction+remodelling:+from+repair+to+regeneration.">Therapies to prevent post-infarction remodelling: from repair to regeneration.</a> Biomaterials. 275, (2021).</li><li>Zhu, R., Sun, H., Yu, K., Zhong, Y., Shi, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-37+and+dendritic+cells+treated+with+interleukin-37+plus+troponin+I+ameliorate+cardiac+remodeling+after+myocardial+infarction.">Interleukin-37 and dendritic cells treated with interleukin-37 plus troponin I ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction.</a> J Am Heart Assoc. 5 (12), (2016).</li><li>Chang, Y., Zhang, J., Huo, X., Qu, X., Xia, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+rigidity+dictates+colorectal+tumorigenic+cell+stemness+and+metastasis+via+CRAD-dependent+mechanotransduction.">Substrate rigidity dictates colorectal tumorigenic cell stemness and metastasis via CRAD-dependent mechanotransduction.</a> Cell Rep. 38 (7), (2022).</li><li>Seo, Y., Jang, J., Ko, K. P., Zou, G., Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dysregulation+induces+immune+evasion+via+oxidative+stress-activated+PD-L1+in+gastric+cancer.">Actin dysregulation induces immune evasion via oxidative stress-activated PD-L1 in gastric cancer.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Kim, B., Zhang, S., Huang, Y., Ko, K. P., Jung, Y. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRACD+loss+induces+neuroendocrine+cell+plasticity+of+lung+adenocarcinoma.">CRACD loss induces neuroendocrine cell plasticity of lung adenocarcinoma.</a> Cell Rep. 43 (6), (2024).</li><li>Jung, Y. S., Wang, W., Jun, S., Zhang, J., Srivastava, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+CRAD-controlled+cytoskeleton+initiates+mucinous+colorectal+cancer+via+&#946;-catenin.">Deregulation of CRAD-controlled cytoskeleton initiates mucinous colorectal cancer via &#946;-catenin.</a> Nat Cell Biol. 20 (11), 1303-1314 (2018).</li><li>Liu, Z., Cao, H., Shi, Y., Yang, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIAA1211+plays+an+oncogenic+role+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">KIAA1211 plays an oncogenic role in human non-small cell lung cancer.</a> J Cancer. 10 (26), 6747-6753 (2019).</li><li>Snider, P. L., Snider, E., Simmons, O., Lilly, B., Conway, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uncharacterized+mKiaa1211+expression+during+mouse+development+and+cardiovascular+morphogenesis.">Analysis of uncharacterized mKiaa1211 expression during mouse development and cardiovascular morphogenesis.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 6 (2), (2019).</li><li>Lin, Y. H., Warren, C. M., Li, J., McKinsey, T. A., Russell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibril+growth+during+cardiac+hypertrophy+is+regulated+through+dual+phosphorylation+and+acetylation+of+the+actin+capping+protein+CapZ.">Myofibril growth during cardiac hypertrophy is regulated through dual phosphorylation and acetylation of the actin capping protein CapZ.</a> Cell Signal. 28 (8), 1015-1024 (2016).</li><li>Yang, F. H., Pyle, W. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cardiac+CapZ+protein+protects+hearts+against+acute+ischemia-reperfusion+injury+and+enhances+preconditioning.">Reduced cardiac CapZ protein protects hearts against acute ischemia-reperfusion injury and enhances preconditioning.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (3), 761-772 (2012).</li><li>Tong, C., Huang, G., Ashton, C., Wu, H., Yan, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+cost-effective+gene+targeting+in+rat+embryonic+stem+cells+by+TALENs.">Rapid and cost-effective gene targeting in rat embryonic stem cells by TALENs.</a> J Genet Genomics. 39 (6), 275-280 (2012).</li><li>Cordes, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethyl-N-nitrosourea+mutagenesis:+boarding+the+mouse+mutant+express.">N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis: boarding the mouse mutant express.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69 (3), 426-439 (2005).</li><li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Kanke, K. L., Rayner, R. E., Bozik, J., Abel, E., Venugopalan, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+with+internal+base+modifications+mediates+highly+efficient+knock-in+in+primary+cells+using+CRISPR-Cas9.">Single-stranded DNA with internal base modifications mediates highly efficient knock-in in primary cells using CRISPR-Cas9.</a> Nucleic Acids Res. 52 (22), 13561-13576 (2024).</li><li>Mihos, C. G., Liu, J. E., Anderson, K. M., Pernetz, M. A., O'Driscoll, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speckle-tracking+strain+echocardiography+for+the+assessment+of+left+ventricular+structure+and+function:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Speckle-tracking strain echocardiography for the assessment of left ventricular structure and function: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 152 (10), (2025).</li><li>Garg, P. K., Biggs, M. L., Kizer, J. R., Shah, S. J., Psaty, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+dysregulation+and+subclinical+cardiac+dysfunction+in+older+adults:+the+Cardiovascular+Health+Study.">Glucose dysregulation and subclinical cardiac dysfunction in older adults: the Cardiovascular Health Study.</a> Cardiovasc Diabetol. 21 (1), (2022).</li><li>Asanuma, T., Fukuta, Y., Masuda, K., Hioki, A., Iwasaki, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+myocardial+ischemic+memory+using+speckle+tracking+echocardiography.">Assessment of myocardial ischemic memory using speckle tracking echocardiography.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 5 (1), 1-11 (2012).</li><li>Chong, S. Y., Zharkova, O., Yatim, S. M. J. M., Wang, X., Lim, X. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+cytoplasmic+domain+exacerbates+post-infarct+left+ventricular+remodeling+via+orchestrating+cardiac+inflammation+and+angiogenesis.">Tissue factor cytoplasmic domain exacerbates post-infarct left ventricular remodeling via orchestrating cardiac inflammation and angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (19), 9243-9261 (2021).</li><li>Hung, C. L., Verma, A., Uno, H., Shin, S. H., Bourgoun, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+circumferential+strain+rate,+left+ventricular+remodeling,+and+prognosis+after+myocardial+infarction.">Longitudinal and circumferential strain rate, left ventricular remodeling, and prognosis after myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1812-1822 (2010).</li><li>Labuhn, M., Adams, F. F., Ng, M., Knoess, S., Schambach, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+sgRNA+efficacy+prediction+improves+large-+and+small-scale+CRISPR-Cas9+applications.">Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications.</a> Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).</li><li>Wu, J., Bu, L., Gong, H., Jiang, G., Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heart+rate+and+anesthetic+timing+on+high-resolution+echocardiographic+assessment+under+isoflurane+anesthesia+in+mice.">Effects of heart rate and anesthetic timing on high-resolution echocardiographic assessment under isoflurane anesthesia in mice.</a> J Ultrasound Med. 29 (12), (2010).</li><li>Voigt, J. U., Pedrizzetti, G., Lysyansky, P., Marwick, T. H., Houle, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+for+a+common+standard+for+2D+speckle+tracking+echocardiography:+consensus+document+of+the+EACVI/ASE/Industry+Task+Force+to+standardize+deformation+imaging.">Definitions for a common standard for 2D speckle tracking echocardiography: consensus document of the EACVI/ASE/Industry Task Force to standardize deformation imaging.</a> J Am Soc Echocardiogr. 28 (2), 183-193 (2015).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), (2014).</li><li>Gao, E., Lei, Y. H., Shang, X., Huang, Z. M., Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>R&#246;sner, A., Barbosa, D., Aars&#230;ther, E., Kj&#248;n&#229;s, D., Schirmer, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+frame+rate+on+two-dimensional+speckle-tracking+strain+measurements:+a+study+on+silico-simulated+models+and+images+recorded+in+patients.">The influence of frame rate on two-dimensional speckle-tracking strain measurements: a study on silico-simulated models and images recorded in patients.</a> Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16 (10), 1137-1147 (2015).</li><li>Argiro, A., Bui, Q., Hong, K. N., Ammirati, E., Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+gene+therapy+in+cardiomyopathies.">Applications of gene therapy in cardiomyopathies.</a> JACC Heart Fail. 12 (2), 248-260 (2024).</li><li>Micheletti, R., Plaisance, I., Abraham, B. J., Sarre, A., Ting, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Wisper+controls+cardiac+fibrosis+and+remodeling.">The long noncoding RNA Wisper controls cardiac fibrosis and remodeling.</a> Sci Transl Med. 9 (395), (2017).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Juliano, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+therapeutic+oligonucleotides.">The delivery of therapeutic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6518-6548 (2016).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

In dieser Studie haben wir eine mit CRISPR/Cas9 erzeugte Cracd-defiziente Maus generiert und einen Arbeitsablauf etabliert, um sie nach Myokardinfarkt mittels konventioneller Echokardiographie, Strain-Bildgebung mit Speckle-Tracking und Histologie zu phänotypisieren. Das Protokoll erzeugte Knockouts mit nachgewiesener Abwesenheit des CRACD-Proteins. Cracd-defiziente Mäuse zeigten nach Myokardinfarkt eine geringere ventrikuläre Dilatation, eine bessere Ejektionsfraktion (EF) und reduzierte Fibrose im Vergleich zu WT-Kontrollen, was die Nützlichkeit des Modells für die Untersuchung der kardialen Remodeling-Prozesse bestätigt.
Der Erfolg dieses Modells hängt von mehreren kritischen Schritten ab. Die Gestaltung der gRNA und deren Validierung in vitro beeinflussen direkt die Effizienz der Zygoten-Editierung23. Wir verwenden CRISPick oder Benchling, um gRNAs mit CRISPRater-Scores ≥ 0,5 auszuwählen, und testen anschließend die Spaltungs-Effizienz mittels eines in-vitro-Cas9/gRNA-Assays. Nur gRNAs mit einer Spaltungseffizienz von &gt; 50 % werden mikroinjiziert. Eine korrekte LAD-Ligatur ist ebenso entscheidend: Die 7‑0-Naht muss 2–3 mm vom Ursprung der LAD entfernt in einer Tiefe von 0,5–1 mm gesetzt werden, um eine Perforation des rechten Ventrikels (zu tief) oder ein Versagen der Gefäßokklusion (zu flach) zu vermeiden; eine sofortige Aufhellung der vorderen Wand bestätigt die Okklusion. Auch die Kontrolle der Herzfrequenz während der Echokardiographie ist wesentlich24. Durch Anpassung der Isofluran-Konzentration (typischerweise 1–2 %) wird eine Frequenz von 450–550 Schlägen pro Minute aufrechterhalten, was die Reproduzierbarkeit konventioneller und Dehnungsmessungen verbessert. Schließlich ist für die Analyse mittels Spackle-Tracking eine visuelle Beurteilung des farbcodierten Netzes unerlässlich25. Das Netz muss den myokardialen Begrenzungen folgen, ohne ruckartige Bewegungen; andernfalls ist eine manuelle Nachbearbeitung erforderlich. Falls nach drei Versuchen die Qualität weiterhin unzureichend ist, wird die Maus ausgeschlossen.
Auch bei sorgfältiger Einhaltung des Protokolls können bestimmte technische Schwierigkeiten auftreten. Systematisches Fehlerbeheben kann die meisten davon beheben. Niedrige Keimbahn-Übertragungsraten (unter 10 %) deuten gewöhnlich auf eine schlechte Integration des Donator-Oligonukleotids oder eine schwache gRNA-Aktivität hin26. Daher können eine Erhöhung der Donator-Oligo-Konzentration auf 20 ng/µL, eine Verlängerung der Homologiemarker auf 120–200 bp und eine erneute Überprüfung der gRNA-Schneideaktivität (&#62; 50 %) die Übertragungsrate verbessern. Eine hohe Sterblichkeit nach MI (über 30 %) resultiert oft aus Pneumothorax, Blutungen und einer großen Infarktzone27. Daher senken die kontinuierliche Sauerstoffgabe bis zur Wiedererlangung der Bewusstlosigkeit und die Verwendung einer Heizplatte zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur die Sterblichkeitsrate deutlich. Wenn die vordere Wand nach der Ligatur nicht blass wird, wurde wahrscheinlich die LAD falsch identifiziert oder die Naht ist zu flach. In diesem Fall helfen die erneute Lokalisation der LAD (ein hellrotes diagonales Gefäß) und das erneute Einführen der Nadel in einer Tiefe von 0,5–1 mm, gegebenenfalls unter Verwendung eines Operationsmikroskops. Bei schlechter Qualität der Fleckverfolgung (Speckle-Tracking) sind üblicherweise eine niedrige Bildfrequenz, unscharfe Grenzen oder Bewegungsartefakte die Ursache28. Entsprechend helfen eine Erhöhung der Bildfrequenz, eine Feinabstimmung der Verstärkung (Gain), eine manuelle Korrektur der endokardialen Kontur und das Ausschließen von Zyklen mit Arrhythmien. 
Abgesehen von diesen praktischen Überlegungen weist die Methode klare Einschränkungen auf. Der Cracd-Knockout ist global, sodass CRACD in allen Geweben fehlt. Folglich kann der beobachtete Schutz nicht ausschließlich auf Kardiomyozyten zurückgeführt werden, da auch systemische Beiträge eine Rolle spielen könnten. Um zelltypspezifische Funktionen voneinander abzugrenzen, wäre ein bedingter Knockout erforderlich. Eine weitere Einschränkung ist der einzige Zeitpunkt am Tag 7; über die chronische Umbildung erfahren wir nichts. Daher sollten spätere Zeitpunkte (4 oder 8 Wochen) für Langzeitstudien hinzugefügt werden. Die Reproduzierbarkeit leidet zudem unter der Abhängigkeit von der Bildqualität: Nicht jedes Ultraschallsystem liefert scharfe endokardiale Grenzen, und die Erfahrung des Bedieners spielt eine Rolle. Deshalb wird empfohlen, dass alle Operationen und Messungen von einem professionell ausgebildeten Personal durchgeführt werden.
Angesichts dieser Einschränkungen ist es sinnvoll, unseren Ansatz mit alternativen Strategien zur Untersuchung der Genfunktion bei der postinfarktbedingten Remodellierung zu vergleichen. Die AAV-vermittelte Genmanipulation und Antisense-Oligonukleotide (ASOs) sind zwei gängige Alternativen29,30. AAV9 kann eine kardialspezifische, vorübergehende Überexpression oder Abschaltung ohne Züchtung ermöglichen, weist jedoch Einschränkungen wie eine begrenzte Packkapazität (~4,7 kb), variable Transduktionseffizienz und Off-Target-Effekte auf31. Im Gegensatz dazu bietet unser CRISPR/Cas9-Knockout-Modell einen permanenten und vollständigen Funktionsverlust, was für Langzeitstudien vorteilhaft ist. ASOs ermöglichen eine reversible, dosisabhängige Abschaltung mit schnellem Wirkungseintritt und eignen sich daher für akute Interventionen; sie erfordern jedoch wiederholte Applikationen und weisen keine Gewebespezifität auf32. Daher eignet sich der hier beschriebene konstitutive Knockout am besten für die anfängliche Entdeckung und die chronische Phänotypisierung.
Schließlich kann das Protokoll weit über CRACD hinaus angewendet werden. Derselbe Arbeitsablauf – die Erzeugung von Knockout-Mäusen mittels CRISPR/Cas9 in Kombination mit Echokardiographie, Dehnungsabbildung und Histologie – ermöglicht die Untersuchung jedes Kandidatengens bei der postinfarktbedingten Umbildung. Der Phänotypisierungsansatz eignet sich ebenfalls für andere kardiovaskuläre Krankheitsmodelle, wie beispielsweise die transversale Aortenkonstriktion (Drucküberlastung) oder Ischämie-Reperfusionsschäden. Zudem können die im Rahmen dieses Protokolls gewonnenen Gewebeproben für Multi-Omics-Analysen (Transkriptomik, Proteomik, Metabolomik) verwendet werden, um molekulare Mechanismen aufzuklären. Das Cracd-defiziente Modell kann als Werkzeug für die Wirkstoffprüfung dienen: Verbindungen, von denen vermutet wird, dass sie über den CRACD-Signalweg wirken, können evaluiert werden. Dadurch bietet dieses Protokoll eine Plattform, die an eine breite Palette mechanistischer und translationsorientierter Studien in der kardiovaskulären Forschung angepasst werden kann.

Myokardinfarkt (MI) ist weltweit weiterhin eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität und belastet die globale Herz-Kreislauf-Gesundheit erheblich1. Die Langzeitprognose nach einem MI hängt hauptsächlich vom Prozess der linksventrikulären (LV) Remodellierung ab2, der eine Ventrikeldilatation, Wandverdünnung und interstitielle Fibrose umfasst3,4, welche wesentliche Faktoren für die Progression zur Herzinsuffizienz (HF) darstellen. Die globale Inzidenz von HF, die auf einer kardialen Remodellierung nach MI beruht, verschärft die Belastung durch kardiovaskuläre Erkrankungen zusätzlich5. Trotz dieser gut etablierten klinischen Beobachtungen fehlen systematische Studien, die empfindliche und reproduzierbare In-vivo-Modelle nutzen, um die Rolle spezifischer Gene bei der postinfarktbedingten Remodellierung zu untersuchen. Derzeit existiert kein Protokoll, das ein mittels CRISPR/Cas9 erzeugtes Knockout-Modell mit fortschrittlicher Dehnungsbildgebung kombiniert, um einen zytoskelettalen Regulator wie CRACD zu evaluieren. Daher besteht dringender Bedarf an einer Methode, die eine präzise genetische Modifikation und eine hochauflösende kardiale Phänotypisierung ermöglicht.
Der Capping-Protein-hemmende Regulator der Aktindynamik (CRACD), auch bekannt als KIAA1211, ist ein Regulator der Aktinpolymerisation, der vorwiegend im Cytosol lokalisiert ist und eine entscheidende Rolle in der Dynamik des Cytoskeletts spielt6. Er reguliert die Aktinpolymerisation positiv, indem er an Aktin-Capping-Proteine (CAPZA1, CAPZA2, CAPZB) bindet und dadurch verhindert, dass diese an die barbierten Enden der Aktinfilamente binden7. In epithelialen Geweben spielt CRACD eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellmorphologie und der Signaltransduktion, indem er die Integrität des Aktincytoskeletts bewahrt8,9. In Tumorzellen ist eine Fehlregulation von CRACD mit einer verstärkten Metastasierung und Proliferation der Zellen assoziiert6,10. Die Rolle von CRACD im Herzen ist bisher nicht vollständig verstanden. Kardiale Transkriptom- und experimentelle Interventionsstudien zeigen, dass die Genexpression von Cracd auf pathologischen Stress reagiert und möglicherweise Gene reguliert, die mit der Cytoskelettdynamik während des ventrikulären Remodelings in Verbindung stehen9,11. Darüber hinaus ist das hemmende Protein CapZ eng mit kardialer Pathologie verknüpft: Die Phosphorylierung von CapZ reguliert das Wachstum von Myofibrillen während der durch Phenylephrin induzierten Hypertrophie12. Unsere früheren Untersuchungen deuten darauf hin, dass eine moderate Herunterregulierung von CRACD einen Schutz vor myokardialem Schaden bietet und die Kontraktilität der Myofilamente nach akuter Ischämie erhält13. Diese Befunde legen die Möglichkeit nahe, dass CRACD eine Rolle bei maladaptiven ventrikulären Remodeling-Prozessen nach einem Myokardinfarkt (MI) spielt. Systematische in-vivo-Verlust-an-Funktion-Studien, die testen, ob ein Cracd-Mangel das Remodeling nach einem MI beeinflusst, fehlten bisher jedoch weitgehend, hauptsächlich aufgrund des Fehlens eines validierten Schritt-für-Schritt-Protokolls zur Erzeugung und Phänotypisierung einer Cracd-defizienten Maus unter ischämischem Stress.
Es existieren mehrere Ansätze zur Erzeugung konstitutiver Knockout-Mäuse. Die traditionelle homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) ist präzise, jedoch kostspielig, zeitaufwändig (12–18 Monate) und auf bestimmte Mausstämme beschränkt14. Die ENU-(N-Ethyl-N-nitrosarn)mutagenese erzeugt zufällige Punktmutationen, die umfangreiches Rückkreuzen und Sequenzieren erfordern15. Im Gegensatz dazu bietet CRISPR/Cas9 deutliche praktische Vorteile für diese Studie: (i) die direkte Injektion in Zygote verkürzt die Zeitspanne auf 4–6 Monate; (ii) sie ermöglicht die Deletion eines großen genomischen Fragments (3153 bp), um einen vollständigen Funktionsverlust sicherzustellen; (iii) sie wirkt direkt auf dem C57BL/6N-Hintergrund, ohne dass ein Stammwechsel erforderlich ist; und (iv) sie verzichtet auf einen selektierbaren Marker, wodurch unbeabsichtigte transkriptionelle Störungen minimiert werden. Daher ist CRISPR/Cas9 die effizienteste Methode, um eine Cracd-defiziente Linie zu erzeugen, die sich für routinemäßige kardiovaskuläre Phänotypisierung eignet. Diese Technologie wurde bereits häufig für präzise in vivo-Funktionsverluststudien verwendet16,17.
Die Bildgebung mittels Speckle-Tracking-Dehnungsanalyse ist eine Nachbearbeitungstechnik, die die Bewegung natürlicher akustischer Speckles im Myokard bildweise verfolgt und dadurch die Berechnung myokardialer Deformationsparameter wie Dehnung (relativer Längenänderung) und Dehnungsgeschwindigkeit (Verformungsrate) ermöglicht18. Im Gegensatz zur konventionellen M-Modus- oder zweidimensionalen Echokardiographie, die globale Funktionsparameter liefert (Auswurfsvolumen, Fractional Shortening, interner Durchmesser des linken Ventrikels) und relativ unempfindlich gegenüber regionalen Wandbewegungsstörungen ist, kann die Dehnungsanalyse die segmentale Kontraktionsfunktion quantifizieren. Dies ist besonders in der frühen Phase nach einem Infarkt von Bedeutung, in der eine kompensatorische Hyperkinese nicht infarktbedingter Segmente die globale Ejektionsfraktion trotz signifikanter regionaler Dysfunktion aufrechterhalten kann. Das Speckle-Tracking bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Endpunkten: Es liefert segmentale Werte für Dehnung und Dehnungsgeschwindigkeit sowie für Verschiebung und Geschwindigkeit und ermöglicht so den Nachweis subtiler, subklinischer Veränderungen19; es kann Dysynchronie und frühe kontraktile Defizite erkennen, bevor irreversible Umbauprozesse eintreten; und es untersucht direkt das subendokardiale Myokard, die am stärksten durch Ischämie gefährdete Schicht20. In dieser Studie ist CRACD ein zytoskelettaler Regulator, der möglicherweise die Myofibrillen-Kontraktilität auf mikroskopischer Ebene beeinflusst. Herkömmliche, auf Hohlraumgrößen basierende Messungen könnten solche lokalen mechanischen Effekte leicht übersehen. Daher verbessert die Integration der Speckle-Tracking-Analyse in dieses Protokoll die Fähigkeit, frühe protektive Effekte des Cracd-Defizits nachzuweisen. Folglich stellt die Einbindung des Speckle-Trackings in dieses Protokoll ein empfindliches und quantitatives Werkzeug zur Beurteilung des postinfarktbedingten Umbaus dar, insbesondere während der ersten Woche nach dem Myokardinfarkt, wenn sich frühe Dilatation und kontraktile Dysfunktion zeigen21,22.
Dieses Protokoll ist für Forscher konzipiert, die den funktionellen Einfluss einer spezifischen Genlöschung auf die akute (7-Tage-)Remodellierung nach Myokardinfarkt mithilfe einer Kombination aus konstitutivem Knockout und hochauflösender Bildgebung untersuchen. Es eignet sich für hypothesengenerierende Studien, bei denen ein globaler Verlust des Zielgens akzeptabel ist und der primäre Endpunkt in frühen systolischen Funktionen und strukturellen Veränderungen liegt. Es sollten jedoch mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Erstens handelt es sich beim Cracd-defizienten Mausmodell um einen globalen Knockout; daher können beobachtete kardioprotektive Effekte nicht ausschließlich auf den Verlust von CRACD in Kardiomyozyten zurückgeführt werden, da auch systemische Beiträge eine Rolle spielen könnten. Zukünftige Studien mit bedingten Knockout-Strategien werden notwendig sein, um eine herzspezifische Deletion zu erreichen. Zweitens konzentriert sich das Protokoll auf einen einzigen Zeitpunkt (Tag 7) und berücksichtigt weder die chronische Remodellierung noch den Fortschritt einer Herzinsuffizienz. Längsschnittstudien über die akute Phase hinaus werden erforderlich sein. Drittens erfordert die Ultraschall-Speckle-Tracking-Analyse hochwertige Bilder (klare endokardiale Grenzen) sowie spezielle Software, die möglicherweise nicht in allen zentralen Einrichtungen verfügbar ist. Trotz dieser Einschränkungen bietet das Protokoll eine robuste und reproduzierbare Plattform für die erste funktionelle Charakterisierung von Genen, die an der kardialen Remodellierung nach Myokardinfarkt beteiligt sind.
In dieser Studie sollte das CRISPR/Cas9-System genutzt werden, um ein Cracd-defizientes Mausmodell (C57BL/6N-Cracdem1 (c.538-83 to c.3352+255 del)) zu erzeugen und zu validieren, um die Auswirkungen eines Cracd-Defizits auf die kardiale Remodellierung und die Ventrikelfunktionsbewegung nach einem Myokardinfarkt (MI) zu untersuchen. Bei sowohl wildtypischen (WT, C57BL/6N) als auch Cracd-defizienten Mäusen wurde ein Myokardinfarkt induziert, und eine umfassende Bewertung erfolgte eine Woche nach dem Infarkt. Die Untersuchungen umfassten konventionelle echokardiographische Parameter, die Strain-Analyse mittels Speckle-Tracking sowie eine histopathologische Beurteilung. Besonderes Augenmerk lag auf der frühen postinfarktbedingten Phase (Tag 7), um die initialen Remodellevents zu erfassen und festzustellen, ob das Cracd-Defizit die ventrikuläre Dilatation und die systolische Funktion während der akuten MI-Phase beeinflusst. Die Ergebnisse sollen wertvolle Erkenntnisse über die Rolle von CRACD bei der Modulation einer nachteiligen kardialen Remodellierung nach einem Myokardinfarkt liefern.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ACRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma-Hydrochlorid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>Verwendung zur Herstellung des DNA-Extraktionspuffers</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>Verwendung zur Verdauung von Mäuseschwänzen</td></tr><tr><td>Green Taq Mix</td><td>Vazyme, China</td><td>P131</td><td>Verwendung zur PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioFroxx, Deutschland</td><td>1110GR500</td><td>Verwendung für DNA-Gelelektrophorese bei 1&amp;ndash;2 % Konzentration</td></tr><tr><td>DNA-Marker</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>Verwendung als DNA-Ladder zur Größenbestimmung von PCR-Produkten</td></tr><tr><td>TIANamp Genomisches DNA-Kit</td><td>Tiangen Biotech, China</td><td>DP304</td><td>Verwendung zur Extraktion genomischer DNA aus Mäuseschwanzgewebe</td></tr><tr><td>MEGAshortscript&amp;trade; T7-Transkriptionskit</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>Verwendung zur in-vitro-Transkription von gRNA</td></tr><tr><td>RNA-Reinigungskit</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>Verwendung zur Reinigung transkribierter gRNA</td></tr><tr><td>BeyoCRISPR&amp;trade; sgRNA-Screening-Kit</td><td>Beyotime, China</td><td>D8412S</td><td>Verwendung zur in-vitro-Bewertung der gRNA-Spaltaktivität</td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>Verwendung zum Schutz vor RNA-Abbau während der in-vitro-Transkription</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>R001A</td><td>Verwendung zur PCR-Genotypisierung von Mäuseschwanz-DNA</td></tr><tr><td>FERTIUP&amp;reg; Maus-Spermien-Präinkubationsmedium: PM</td><td>Cosmo Bio, Japan</td><td>KYD-002-EX</td><td>Verwendung zur Spermienkapazitation vor der In-vitro-Fertilisation</td></tr><tr><td>T7 ARCA mRNA-Kit</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Verwendung zur in-vitro-Transkription von Cas9-mRNA</td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>Verwendung zur Superovulation, verabreicht per intraperitonealer Injektion</td></tr><tr><td>Menschliches Choriongonadotropin</td><td>ProSpec, Israel</td><td>HOR-250</td><td>Verwendung zur Induktion des Eisprungs, verabreicht per intraperitonealer Injektion</td></tr><tr><td>RNase-freies Wasser</td><td>Aladdin, China</td><td>R665526</td><td>Verwendung zur RNA-Auflösung und PCR-Ansatzherstellung</td></tr><tr><td>Primer</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>/</td><td>Verwendung zur Genotypisierung</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chirurgie&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>RWD Life Science, China</td><td>R510-22-10</td><td>Verwendung zur Einleitung und Aufrechterhaltung der Anästhesie während der Operation</td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Veet, Frankreich</td><td>1000207</td><td>Wird auf den Brustbereich aufgetragen, um das Fell vor der Operation und Ultraschalluntersuchung zu entfernen</td></tr><tr><td>7-0 Nahtmaterial</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ7022380206</td><td>Verwendung zur dauerhaften Ligatur der linken absteigenden Koronararterie (LAD)</td></tr><tr><td>4-0 Nahtmaterial</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ4022380412</td><td>Verwendung zum Verschluss der Hautinzision nach der Operation</td></tr><tr><td>Anästhesiebeatmungsgerät</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>Tabletop</td><td>Verwendung zur Zufuhr von Isofluran und zur Unterstützung der Atmung</td></tr><tr><td>Kleintier-Beatmungsgerät</td><td>Taimeng, China</td><td>HX-101E</td><td>Verwendung zur Bereitstellung einer positiven Druckbeatmung während der Brustkorb-Operation</td></tr><tr><td>Konstanttemperatur-Heizplatte</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>Verwendung zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur der Maus während der Operation und Erholungsphase</td></tr><tr><td>Rippenretraktor</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>LN-18-4101</td><td>Verwendung zum Auseinanderziehen der Rippen und Freilegen des Herzens für die LAD-Ligatur</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-0551</td><td>Verwendung zum Anlegen von Hautschnitten und zum Durchtrennen von Gewebe</td></tr><tr><td>Stereo-Mikroskop</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ 745</td><td>Verwendung zur vergrößerten Darstellung während der LAD-Arterienligatur-Operation</td></tr><tr><td>Mikroskopische Nadelhalter</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-2211</td><td>Verwendung zum Handhaben der kleinen 7-0-Nadel unter dem Mikroskop</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemikalien und Reagenzien&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schallkopfkopplungsmittel</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, China</td><td>TM-100</td><td>Wird auf die Brust für die Echokardiographie aufgetragen, sorgt für guten Sondenschluss</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>Verwendung zur Fixierung von Herzgewebe nach der Entnahme</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Macklin, China</td><td>1330-20-7</td><td>Verwendung zur Paraffinentfernung und Gewebeaufhellung vor der Färbung</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>Kernfärbung, Verwendung in der HE-Färbung</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>Cytoplasmafärbung, Verwendung in der HE-Färbung</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>Verwendung in der Masson-Färbung zur Cytoplasmafärbung</td></tr><tr><td>Phosphormolybdänsäure</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>Verwendung in der Masson-Färbung als Beize und zur Differenzierung</td></tr><tr><td>Anilinblau-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>Verwendung in der Masson-Färbung zur Kollagenfasernfärbung (blau)</td></tr><tr><td>CRACD-Antikörper</td><td>Absea, China</td><td>KC-35356</td><td>Primärantikörper zum Nachweis des CRACD-Proteins mittels Western Blot, Verdünnung 1:2000</td></tr><tr><td>GAPDH-Antikörper</td><td>CST, USA</td><td>2118S</td><td>Ladungskontrollantikörper für den Western Blot, Verdünnung 1:5000</td></tr><tr><td>Äthanol</td><td>Macklin, China</td><td>64-17-5</td><td>Verwendung zur Dehydrierung und Reagenzherstellung (70 %, 80 %, 95 %, 100 % Stufen)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Laborgeräte&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&amp;trade; Legend&amp;trade; Micro 17 Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>Verwendung zur routinemäßigen Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>PCR-Thermocycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>Verwendung zur DNA-Amplifikation</td></tr><tr><td>Mikroinjektionssystem</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>5193000020</td><td>Verwendung zur Mikroinjektion von CRISPR/Cas9-Reagenzien in Zygoten</td></tr><tr><td>Vevo 2100 Bildgebungssystem</td><td>VisualSonics, Kanada</td><td>Vevo2100</td><td>Hochfrequenz-Bildgebungssystem zur nicht-invasiven Beurteilung der Herzfunktion und -struktur nach Myokardinfarkt</td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Leica, Deutschland</td><td>DM2500</td><td>Verwendung zur Beobachtung von HE- und Masson-gefärbten Herzschnitten</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Analyse-Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>/</td><td>Verwendung zur Bildanalyse, einschließlich Flächenmessung, Signalquantifizierung und Verarbeitung histologischer Bilder (HE- und Masson-Färbung)</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, Kanada</td><td>/</td><td>VevoLab-Software zur Analyse der Herzfunktion; VevoStrain-Modul zur Analyse der myokardialen Dehnung zur Beurteilung der Herzleistung nach Myokardinfarkt</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>Verwendung zur statistischen Analyse und Erstellung von Grafiken</td></tr></tbody></table>

generierung und phänotypische charakterisierung eines mit crispr/cas9 hergestellten cracd-defizienten mausmodells für studien zur remodelung nach myokardinfarkt

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myocardial infarction (MI) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. This protocol describes a method for generating and characterizing a Cracd-deficient mouse line on the C57BL/6N background using CRISPR/Cas9 technology. Zygotes were co-injected with Cas9 mRNA, a gRNA construct, and a donor template designed to generate a 3153-bp genomic deletion. The edited allele was confirmed by PCR genotyping and Sanger sequencing. To assess the functional role of CRACD in post-MI remodeling, Cracd-deficient and wild-type (WT, C57BL/6N) mice underwent MI induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. On postoperative day 7, cardiac function and left ventricular wall motion were assessed using transthoracic echocardiography and speckle-tracking strain imaging, followed by histopathological evaluation with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Representative results showed that Cracd-deficient mice exhibited reduced ventricular dilation and preserved systolic function compared to WT controls. This protocol provides a reliable experimental platform for mechanistic studies of CRACD in cardiac pathophysiology.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und phänotypische Charakterisierung eines C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del)-Mausmodells mittels CRISPR/Cas9-Technologie, um die Rolle von CRACD bei der kardialen Remodeling nach Myokardinfarkt zu untersuchen.

Generierung und phänotypische Charakterisierung eines mit CRISPR/Cas9 hergestellten Cracd-defizienten Mausmodells für Studien zur Remodelung nach Myokardinfarkt

Der Myokardinfarkt (MI) bleibt weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. In diesem Protokoll wird eine Methode zur Erzeugung und Charakterisierung von ... beschrieben.

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

generation-phenotypic-characterization-crisprcas9-engineered-cracd

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir stellen ein chirurgisches Verfahren, experimentelle Ischämie / Reperfusions (I / R) Schädigung induzieren Myokardinfarkt (MI) in Mausmodellen, die für mehr Klarheit in der Positionierung der Ligation an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) simulieren können, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen MI Experimente in Mäusen.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Herzinsuffizienz ist die Hauptursache für Krankenhausaufenthalte und eine der Haupttodesursachen. Ein Modell der permanenten Ligatur der linken anterioren absteigenden Koronararterie bei Mäusen wird angewendet, um den ventrikulären Umbau und die kardiale Dysfunktion nach einem Myokardinfarkt zu untersuchen. Die Technik der invasiven hämodynamischen Messungen an Mäusen wird vorgestellt.

Permanent Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie bei Mäusen: Ein Modell der Post-Myokardinfarkt Umbau und Herzinsuffizienz

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Dieser Artikel zeigt ein Modell zur Untersuchung des Herzumbaus nach Myokard-Kryoverletzung bei Mäusen.

Ein Cryoinjury-Modell zur Untersuchung des Myokardinfarkts in der Maus

Dieses Protokoll stellt eine einfache und kohärente Möglichkeit dar, ein Gen von Interesse mit modRNA nach Myokardinfarkt bei Mäusen vorübergehend zu regulieren.

Lieferung von Modified mRNA in einem Myokardinfarkt-Mausmodell

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den...

In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter

Es gibt mehrere Unterschiede zwischen dem rechten und linken Ventrikel. Die Pathophysiologie des rechtsventrikulären Infarkts (RVI) ist jedoch nicht geklärt. Im vorliegenden Protokoll wird eine reproduzierbare Methode zur Generierung von RVI-Mausmodellen eingeführt, die ein Mittel zur Erläuterung des Mechanismus von RVI darstellen kann.

Erzeugung und Charakterisierung eines rechtsventrikulären Myokardinfarkts induziert durch permanente Ligation der rechten Koronararterie bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um präzise Knock-in-Bearbeitungen in Zebrafischembryonen mit der CRISPR-Cas9-Technologie zu ermöglichen. Eine Phänotypisierungspipeline wird vorgestellt, um die Anwendbarkeit dieser Techniken zur Modellierung einer Long-QT-Syndrom-assoziierten Genvariante zu demonstrieren.

CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen

Photothrombose ist eine schnelle, minimal-invasive Technik zur Induktion von kleinen und gut abgegrenzt Infarkt in Bereiche von Interesse in sehr reproduzierbar. Es ist besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.

Photothrombotic Ischämie: eine minimal-invasive und reproduzierbare photochemische kortikale Läsion Modell für Mouse Stroke Studies

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

Generierung und phänotypische Charakterisierung eines mit CRISPR/Cas9 hergestellten Cracd-defizienten Mausmodells für Studien zur Remodelung nach Myokardinfarkt

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