Name: Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-04T23:27:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen auf MEF-Feederzellen und Matrigel. Diese Methode zeigt, wie Pluripotenz erhalten und feederfreie Bedingungen etabliert werden.

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Menschliche embryonale Stammzellen-Studien in der Teitell Labor werden von einem California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Saatgut gewähren RS1-00313 unterstützt. Wir danken Mitglieder der Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, vor allem Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, und die Mitglieder des UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility für ihre Unterstützung unserer Studien.

Splitting humanen embryonalen Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) ausplattiert Normalerweise wird eine konfluente hESC Platte kann von 1.06 bis 01.10 Uhr aufgeteilt werden, abhängig von der jeweiligen hESC Linie. Die Split-Platte wird konfluenten wieder 5-7 Tage nach der Trennung. <ol><li> Zwei Tage vor der Spaltung, verkleistern-Platten mit einer 0,1% igen Gelatinelösung. Für eine 6-Well-Platte, fügen 2ml in jede Vertiefung und inkubieren Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator über Nacht. </li><li> Platte MEFs auf verkleistert 6-well Platten am Tag, bevor Sie planen Aufspaltung der HES. (HINWEIS: MEFs können bis zu 3 Tage vorher bei Bedarf beschichtet werden nach ~ 3 Tage, MEFs flacher und spread-out und kann nicht aufrechterhalten hESCs sowie frischer MEFs werden kann..) Nehmen Sie ein Fläschchen mit g-bestrahlt oder Mitomycin C behandelt CF1 MEFs, mit 5-6 x 10 6 Zellen, aus flüssigem Stickstoff und Auftauen für 2 min in einem 37 ° C Wasserbad. Wash Zellen einmal mit warmem MEF Nährmedien in einem 50ml Falcon-Röhrchen und resuspendieren in das endgültige Volumen des warmen MEF Culture Media. Bei 5-6 x 10 6 Zellen, das ist genug, um Platte zwei oder drei 6-well Platten. </li><li> Während die MEFs gewaschen werden, nehmen Sie die verkleistert Platten, entfernen Sie alle Lösungen aus den Vertiefungen und 2,5 ml des MEF Kultur Medien pro Vertiefung. </li><li> 0,5 ml Suspension pro MEF gut zu erreichen 3ml als letzte Band in jedes Well. Stellen Sie sicher, MEFs gleichmäßig verteilt sind und legen Platten wieder in den Inkubator über Nacht zu begleichen. </li><li> Am Tag der hESC Splitting, bereiten Sie frisches oder &lt;2 Wochen alte sterile Kollagenase IV Lösung 1mg/ml. Entfernen Sie alle Medien aus dem Brunnen hESC Sie teilen möchten, einmal abwaschen mit 2ml pro well warm 1 × PBS, pH 7,4, und fügen Sie 1 ml Collagenase IV-Lösung. Bei 37 ° C für 5-10 min. Nehmen Sie die 6-well hESC Platte aus dem Inkubator und 1ml von ES-Medien (ohne bFGF) in jede Vertiefung. Mit der Lösung in jede Vertiefung, mit einer 1 ml Pipette saugen die Medien und blasen die Stammzellen aus der Platte. Für jeden gut das dauert ca. 5 bis 10 Wiederholungen. Dann überweisen Sie den suspendierten hESCs in ein 50ml Falcon-Röhrchen. Tun Sie dies für alle Brunnen, die geteilt und kombinieren in ein 50ml-Falcon-Röhrchen. Pellet der hESCs bei Raumtemperatur bei 200g für 5 min und waschen einmal mit ES Medien fehlt bFGF. </li><li> Während die hESCs gewaschen werden, nehmen Sie die MEF-Platten, entfernen Sie alle Medien aus dem Brunnen und waschen einmal mit steriler, warm 1 x PBS, pH 7,4 fügen Sie dann 2,5 ml ES Medien (jetzt mit 10 ng / ml bFGF ergänzt) pro gut. </li><li> Resuspendieren der pelletierten hESCs in einem geeigneten Volumen ES Medien, mit 10ng/ml bFGF ergänzt. (Hinweis:.. Wenn die hESCs resuspendiert sind, sollten sie von rund einheitlichen Kolonie Größe und Form werden die Resuspension Volumen hängt vom Teilungsverhältnis) vorsichtig pipettieren hESC Aufhängung oben und unten ein paar Mal um die Kolonien kleiner und gleichmäßiger, aber nicht so viel, dass einzelne Zellen oder sehr kleine Kolonien erzeugt werden. 0,5 ml Suspension pro hESC gut an die MEF-Platten bis 3 ml als ein Endvolumen in jeder Vertiefung zu erreichen. Sichtprüfung sicherstellen, dass die hESCs gleichmäßig, bevor die Platten wieder in den Inkubator über Nacht absetzen verteilt. Nach dem Plattieren, wird es in der Regel ein paar Tage dauern um die Kolonien auf ihre charakteristische Form und Grenze Aussehen. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science . 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology+%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen. In den letzten Schritt vor dem Plattieren, wenn die hESCs resuspendiert sind, sollten sie von rund einheitlichen Kolonie Größe und Form sein. Sorgfältig Pipette die hESC Aufhängung oben und unten ein paar Mal um die Kolonien kleiner und gleichmäßiger, aber nicht so viel, dass einzelne Zellen oder sehr kleine Kolonien generated.Immunofluorescence Färbung und Mikroskopie oder Durchflusszytometrie für hESC Pluripotenz ...

<table><tbody><tr><td>Knockout-Serumersatz (KSR)</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagenz</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagenz</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagenz</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagenz</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4-Antikörper</td><td>Reagenz</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyco&amp;#8211;rythrin-konjugiertes Maus-IgG3</td><td>Reagenz</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Antikaninchen-IgG</td><td>Reagenz</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

von mefs auf matrigel i: die passage hescs in gegenwart von mefs

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen.

Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs

Dieses Video demonstriert, wie menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) auf mouse embryonic fibroblast (MEF) Feederzellen kultiviert werden.

Aufgrund ihres erheblichen Potenzials in der regenerativen Medizin rückt die Biologie und Manipulation menschlicher embryonaler Stammzellen zunehmend in den Fokus. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie man menschliche embryonale Stammzellen in einem pluripotenten Zustand unter Verwendung von Maus-embryonalen Fibroblasten-Fütterungszellen sowie fütterungszellfreien Bedingungen auf Matrigel kultiviert und erhält. Hallo, ich bin Jinjiang aus einem Labor-Mikrotitel in der Abteilung für Pathologie und Labormedizin an der University of California Los Angeles.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Kultivierung menschlicher embryonaler Stammzellen auf embryonalen Mausfibroblasten, mit Blutfütterungszellen und unter fütterungsfreien Bedingungen auf Matrigel. Dieses Verfahren umfasst die Vorbereitung von embryonalen Mausfibroblasten, die Herstellung von Meth-Konditioniertem Medium für das Wachstum auf Matrigel, die Vorbereitung der Matrigel-Platte und der Zellklumpen zum Füttern und Kultivieren menschlicher embryonaler Stammzellen über einen längeren Zeitraum. Beginnen wir also.Um das Kulturverfahren zu beginnen, werden humane embryonale Stammzellen auf embryonalen Mausfibroblasten oder Me

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin.

Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.

Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, ​​Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung...

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Trotz anhaltender Bemühungen, um den Übergang Kulturen Feeder-freien Bedingungen, bleiben die Ableitung und Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) weitgehend abhängig von Co-Kulturen mit embryonalen Feeder (MEF). Hier zeigen wir eine neuartige Methode zur schnellen Beseitigung Zubringer vom hESC Kulturen vor den Experimenten.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Hier präsentieren wir Kulturprotokolle für humane pluripotente Stammzellen (hPSC), die auf dem Wachstum von dissoziierten Einzelzellen basieren. Diese neue Methode, bei der Rho-assoziierte Kinase-Inhibitoren oder die Laminin-Isoform 521 (LN-521) verwendet werden, eignet sich für die Herstellung großer Mengen homogener hPSCs, die genetische Manipulation und die Wirkstoffforschung.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Lernen Sie die Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen auf MEF-Feederzellen und Matrigel. Diese Methode zeigt, wie Pluripotenz erhalten und feederfreie Bedingungen etabliert werden.

Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs

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