Name: Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Analyse mitochondrialer Atmungskettenkomplexe in humanen embryonalen Stammzellen mittels In-Gel-Aktivitätsassays. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Stammzellbiologie.

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Menschliche embryonale Stammzellen-Studien in der Teitell Labor werden derzeit von California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Saatgut gewähren RS1-00313 unterstützt. Wir danken Dr. Carla Koehler (UCLA) und Mitglieder der Koehler-Labor für die Beratung und Einblicke in diese und weitere Studien.

Hohe Auflösung Klare nativen Gel Elektrophorese (hrCNE) für Mitochondriale Komplexe In-Gel Aktivitätstests Humane embryonale Stammzellen (hES) wurden auf einem Monolayer von ˠ-bestrahlten oder Mitomycin C-behandelten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), dann das Wachstum auf Matrigel für 5 Tage in MEF-konditioniertem Medium unter Standardbedingungen eingeschaltet gepflegt. So entfernen Sie kontaminieren MEFs wurden hESCs auf Matrigel erneut verzinkt und aufgewachsen in MEF-konditioniertem Medium für weitere 3 Tage. Immunfluoreszenzmikroskopie für Pluripotenz Marker Oct-4 und SSEA-4 verwendet wurde, um den Mangel an menschlichen embryonalen Stammzellen die Differenzierung zu bestätigen. <ol><li> Wash-Zellen mit warmem 1x PBS, pH 7,4, durch Trypsinierung (1 ml 1x Trypsin pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) für 5 min. </li><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen frischen Trypsin Inhibitor (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge bei 200g, 5 min, Raumtemperatur. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren pelletierten Zellen in 0,8 - 1,7 ml (bezogen auf die Größe des Zellpellets) eiskaltem Mitochondrien isoliert Puffer (83mm Saccharose; 6.6mm Imidazol / HCl, pH 7,0) mit frisch zubereiteten 1 &#39;Protease Inhibitor Cocktail. Inkubieren auf Eis für 10 min. </li><li> Dounce Zellen mit einem Homogenisator (~ 40 bis 50 Schläge). Stain einen aliquoten Teil der dounced Zellen mit Trypanblau auf Vollständigkeit der Homogenisierung mit einem Lichtmikroskop zu überprüfen. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C, um eine rohe mitochondriale Pellet enthält auch Kerne und größere Zellfragmente zu erhalten. Dekantieren und den Überstand verwerfen und wiegen das ausgefallene Rohprodukt mitochondriale Pellet. Das Pellet kann bei -80 ° C gelagert werden folgende Instant Einfrieren in flüssigem Stickstoff, ob dies ein Haltepunkt. HINWEIS: Differential Zentrifugation oder andere Gradienten-basierten Verfahren können zur Isolierung und Sammeln einer reinen mitochondrialen Membranfraktion verwendet werden. Siehe Lit.. 4 für Details. Dieser alternative Ansatz wird Ertrag der mitochondrialen Komplex-Aktivität pro mg des mitochondrialen Proteins statt komplexer Aktivität pro mg Zellen Gewicht oder Zellzahl. Die Konzentration der mitochondrialen Proteine ​​müssen nach der Reinigung auf diesen Vergleich zu machen bestimmt werden. Auch kann eine andere Isolation Puffer für diesen Ansatz erforderlich sein. Für die Solubilisierung der reinen mitochondriale Membran-Fraktion, siehe die Anmerkung folgende Schritt 6 unten. </li><li> Solubilisieren das rohe mitochondriale Pellet auf Eis durch Vortexen mit eiskaltem Solubilisierungspuffer (50 mM NaCl, 50 mM Imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2 mM 6-Aminohexansäure). 6-Aminohexansäure kann mit dem 1x Protease Inhibitor Cocktail ersetzt werden. Verwenden Sie 35μl der Solubilisierungspuffer pro 20mg Tablette Gewicht. Add 20 &amp;mgr; l von 10% w / v Digitonin pro 20mg Tablette Gewicht und mischen flicking die Röhre. Inkubieren für 5-10 min auf Eis. Dodecyl-bD-Maltosid oder Triton X-100 kann für Digitonin ersetzt werden, um die Proteine ​​zu lösen. Die Wahl des Waschmittels und die Menge kann sich auf die Bildung von Superkomplexen oder multimere Formen der Mitochondrien-Komplexen. Weitere Informationen finden Sie unter Ref.1. HINWEIS: Die Menge an Waschmittel benötigt, um eine reine mitochondrialen Membranfraktion solubilisieren entspricht einem Detergenz / Protein Gewichtsverhältnis von 2-6g / g. Das optimale Verhältnis der mitochondrialen Membranen lösen sich 2,5 g / g für Dodecyl-bD-Maltosid, 3g / g für Triton X-100 und 6 g / g für Digitonin. </li><li> Centrifuge das gelöste Pellet bei 100.000 g für 15 min bei 4 ° C. Sammeln Sie die klare Überstand. </li><li> Add-Ladepuffer, um eine endgültige 5% w / v Glycerin und 0,01% w / v Ponceau S (mit einem 50% w / v Glycerin, 0,1% w / v Ponceau S Ladepuffer Stammlösung). </li><li> Laden Gel Brunnen mit einem Volumen, das 20-40mg des rohen mitochondrialen Pellet pro Spur enthält. Verwenden Sie ein Acrylamid Gradienten-Gel (4 -13%) mit einem 3,5% Sammelgel. HINWEIS: Gel-Elektrophorese Vorbereitung und Bedingungen: Für Gelzubereitung, verwenden Sie ein Acrylamid / Bisacrylamid (AA / bisAA) 3-Mix wie folgt: 48g Acrylamid und 1,5 g Bisacrylamid (49,5% T, 3% C, wobei T Gesamtkonzentration von AA und bisAA und C der Anteil der Vernetzer (bisAA) zum Gesamtumsatz Monomer). Gel-Puffer (3 &#39;): 1,5 6-Aminohexansäure; 75mm Imidazol, pH 7,0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> Gradient Gel: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> Stacking-Gel: </td><td> 3,5% </td></tr><tr><td> AA / bisAA 3 Mix </td><td> 2 ml </td><td> 6,5 ml </td><td></td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td> Gel-Puffer 3 &#39; </td><td> 8,3 ml </td><td> 8,3 ml </td><td></td><td> 2,7 ml </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td></td><td> 5 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14,7 ml </td><td> 5 ml </td><td></td><td> 4,7 ml </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td></td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> 10% APS </td><td> 139 ul </td><td> 125 ul </td><td></td><td> 67 ul </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 ul </td><td> 12,5 ul </td><td></td><td> 6,7 ul </td></tr></tbody></table> Anode Puffer: 25mM Imidazol / HCl, pH 7,0 Cathode Puffer: 50 mM Tricin, 7,5 mm Imidazol / HCl, 0,02% w / v Dodecyl-bD-Maltosid, 0,05% w / v Desoxycholat, pH 7,0 Gießen und führen Gele in einem kalten Raum (4-7 ° C). Die anfängliche Spannung verwendet wird 100V. Wenn die Probe hat das Stacking-Gel eingegeben, wird die Spannung auf 500 V mit dem Strom begrenzt auf 15mA (für 0,15 &#39;14&#39; 14-cm-Gele) angehoben. Die Elektrophorese wird nach 3-4 h, wenn die scharfe Linie des roten Farbstoff Ponceau S das Gel vor Ansätze gestoppt. Alternativ kann ein Gel über Nacht mit konstanter Spannung betrieben werden bei 70-100V. <ol><li> In-Gel-Aktivitäts-Assays. Die Inkubationszeit für jeden Test hängt von der Effizienz des Proteins Solubilisierung und die Menge an Material pro Vertiefung geladen. Komplexe I, IV und V liefern in der Regel stärkere Signale als Komplexe II und III. </li></ol> Komplex I (CI) Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CI-Puffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden. CI-Puffer: € pro 100 ml 5mM Tris-HCl, pH 7,4: 0.01g NADH 0,25 g NBT Fix das Gel in 50% Methanol und 10% Essigsäure für 15-45 min. Die feste Gel wird in 10% Essigsäure erhalten. Komplex II (CII) Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CII-Puffer (20 mM Natrium-Succinat; 0,2 mM Phenazin methasulfate; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden. CII-Puffer: € pro 100 ml 5mM Tris-HCl, pH 7,4: 200 ul 1M Natriumsuccinat 80μl Phenazin methasulfate (250mm PMS gelöst in DMSO) 0,25 g NBT Fix das Gel für komplexe beschrieben I Komplexe III (CIII) Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CIII-Puffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,2; 0,05% 3,3 &#39;-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden. CIII Puffer: € pro 100 ml 50 mM Natrium-Phosphat, pH 7,2: 50mg Diaminobenzidintetrahydrochlorid Fix das Gel für komplexe beschrieben I Komplex IV (CIV) Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CIV-Puffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,2; 0,05% 3,3 &#39;-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), 50 &amp;mgr; Pferd Cytochrom c) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden. CIV Puffer: € pro 100 ml 50 mM Natrium-Phosphat, pH 7,2: 50mg Diaminobenzidintetrahydrochlorid 0.1g Pferd Cytochrom c Fix das Gel für komplexe beschrieben I Komplexe V (CV) Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CV-Puffer (35mm Tris-base, 270mm Glycin, pH 8,3 bei 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden. CV Puffer: je 100ml Lösung hinzu: <table border="0"><tbody><tr><td> Tris-base </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> Keine Notwendigkeit, pH-Wert (sollte 8,3 sein) einstellen - nicht mit Säure oder Base. Filter und fügen <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> Fix das Gel in 50% Methanol für 30 min und Transfer zum Wasser.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

In diesem Video haben wir die Extraktion von mitochondrialen Protein-Komplexe aus humanen embryonalen Stammzellen, deren Trennung durch hochauflösende klare native Gelelektrophorese (hrCNE), und die anschließende Analyse von in-Gel-katalytische Aktivität beschriebenen Assays. hrCNE löst mitochondriale Membran-Protein-Komplexen mit einer Auflösung vergleichbar mit dem von blue native Gelelektrophorese und ist überlegen in-Gel-Aktivitäts-Assays. Diese Technik kann nicht nur zur mitochondrialen Atmungskette Komplexe IV quantifizieren, aber auc...

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>pH mit NaOH auf 8,0 einstellen </td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1 M Natriumsuccinat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 und BP329-1</td><td>Mischen Sie 68,4 ml 1M Na2HPO4 und 31,6 ml 1M NaH2PO4, um einen 0,1M Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 bei 25 °C herzustellen. </td></tr><tr><td>1 M Tricin, pH 7,0 (mit NaOH eingestellt)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>bei 4 °C lagern </td></tr><tr><td>1 M Imidazol/HCl, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>bei 4 °C lagern</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20 % (Gewicht/Volumen) Dodecyl-β-D-maltosid (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>In Wasser gelöst. 1 ml-Aliquote bei &amp;#8211;20 °C</td></tr><tr><td>10 % (Gew/Vol) Digitonin&amp;gt;50 % Reinheit, verwendet ohne Umkristallisation</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>In Wasser gelöst. Lagern Sie 0,1&amp;#8211;1 ml Aliquote bei &amp;#8211;20 °C. Vor der Verwendung auf 95 °C erwärmen.</td></tr><tr><td>2 M 6-Aminocapronsäure</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>bei 4 °C lagern</td></tr><tr><td>10x Ponceau S/Glycerin-Stammlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 und G6279-1L</td><td>0,1 % Ponceau S, 50 % Glycerin (Gew./Vol.) in Wasser</td></tr><tr><td>10 % (m/V) Natriumdesoxycholat</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>In Wasser gelöst. Lichtgeschützt aufbewahren. Den pH-Wert mit HCl auf 7,0 einstellen, filtrieren und bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>250 mM Phenazinmethasulfat (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>In DMSO gelöst und portioniert. Lagern bei &amp;#8211;20 °C</td></tr><tr><td>Nitroblau-Tetrazolium (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis </td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-5&amp;rsquo;-Triphosphat-Disodiumsalz (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Grad I, mindestens 99 %</td></tr><tr><td>beta-Nicotinamidadenindinukleotid (NADH), reduzierte Form </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c aus Pferdeherz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose </td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x Protease-Inhibitoren-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Lagerung bei &amp;#8211; 20 °C</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung 0,4 %</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x Trypsin (0,5 %)</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsininhibitor </td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

probing für mitochondriale komplexe aktivität in humanen embryonalen stammzellen

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondrien sind Organellen, die zytoplasmatische eine primäre Rolle im Zellstoffwechsel und Homöostase haben, die Regulierung der zellulären Signalübertragung Netzwerk und den programmierten Zelltod. Mitochondrien erzeugen ATP, regulieren die cytoplasmatische Redoxzustand und Ca2 + Balance, katabolisieren Fettsäuren, zu synthetisieren Häm, Nukleotide, Steroidhormone, Aminosäuren, und helfen montieren Eisen-Schwefel-Clustern in Proteinen. Mitochondrien haben auch eine wesentliche Rolle in der Wärmeproduktion. Mutationen des mitochondrialen Genoms verursachen verschiedene Arten von menschlichen Erkrankung. Die Anhäufung von Mutationen der mtDNA korreliert mit dem Alter und steht im Verdacht, eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Krebs haben. Aufgrund ihrer äußerst wichtige Rolle in allen Zelltypen, muss die Funktion der Mitochondrien auch entscheidend für die Stammzellen. Key Fortschritte in unserem Verständnis von Stammzellen Lebensfähigkeit, der Vermehrung und Differenzierung Kapazität gemacht. Aber die funktionelle Aktivität von Stammzellen, insbesondere ihre Energie-Status, war noch nicht im Detail untersucht worden. Fast nichts ist über den mitochondrialen Eigenschaften von humanen embryonalen Stammzellen (hES) und ihrer differenzierten Vorläufer Nachkommen bekannt. Ein Weg, um zu verstehen und bewerten die Rolle der Mitochondrien in hESC Funktion und Entwicklungspotential ist die direkte Messung der Aktivität der mitochondrialen Atmungskette Komplexe. Hier beschreiben wir hochauflösende klare native Gelelektrophorese und anschließender in Gel-Aktivität Visualisierung als Methode zur Analyse der fünf Atmungskette Komplexe von HES.

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie der mitochondrialen Atmungskette Komplexe von humanen embryonalen Stammzellen analysiert werden mit in Gel-Aktivitäts-Assays werden.

Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

Mitochondrien sind zytoplasmatische Organellen, die eine primäre Rolle im Zellstoffwechsel und in der Homöostase, bei der Regulierung des zellulären Signalnetzwerks und ...

Die Mitochondrien haben zahlreiche Funktionen in der Zellphysiologie, von Stoffwechsel und Energieproduktion bis hin zur programmierten Zelltodaktivierung und Synthese von Steroidhormonen. Trotz der Bedeutung von Mitochondrien sowohl für grundlegende zelluläre Funktionen als auch für Krankheiten ist bisher sehr wenig über ihre Funktion in menschlichen embryonalen Stammzellen und deren differenzierten Nachkommen bekannt. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die Atmungskettenkomplexe der Mitochondrien menschlicher Stammzellen mittels In-gel-Aktivitätsassays analysiert werden können.Hallo, ich bin Ivan OV aus dem Labor von Michael Tetel am Department für Pathologie und Labormedizin der University of California Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Atmungskomplexfunktion in humanen embryonalen Stammzellen. Dieses In-Gel-Aktivitätsverfahren beinhaltet die Isolierung eines rohen mitochondrialen Lysats aus humanen embryonalen Stammzellen, die Trennung der mitochondrialen Komplexe des oxidativen Phosphorylierungssystems mittels hochauflösender Clear Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese sowie anschließende In-Gel-Aktivitätsnachweise.Beginnen wir also. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, Mitochondrien aus menschlichen embryonalen Stammzellen zu isolieren. Für diesen Assay verwenden wir menschliche embryonale Stammzellen, die unter fütterungsfreien Bedingungen auf einer mit Matrigel beschichteten Platte kultiviert wurden.Um Mitochondrien aus unseren menschlichen Stammzellen zu isolieren, beginnen wir damit, sie mit warmer 1x-PBS, pH 7,4, zu waschen und anschließend die Zellen fünf Minuten lang mit Trypsin zu behandeln. Dabei kann man je nach Größe der Vertiefung in einer 6-Loch-Platte 1 ml 1x-Trypsin pro Vertiefung verwenden. Nach fünf Minuten kann die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens frischem Trypsininhibitor (1 Milligramm pro Milliliter in 1x-PBS) gestoppt und die Zellen geerntet werden.Die gesammelten Zellen werden anschließend bei 200 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand verworfen und das Zellenpellet in 0,8 bis 1,7 Milliliter eiskaltem Mitochondrien-Isolierpuffer mit einer frisch zubereiteten Cocktailslösung aus 1× Proteaseinhibitor resuspendiert. Die Menge des verwendeten Puffers hängt von der Größe des erhaltenen Zellenpellets ab. Nachdem das Pellet resuspendiert wurde, wird es etwa 10 Minuten auf Eis inkubiert.Nach der Inkubation lysieren wir die Zellen mit einem Homogenisator, was etwa 40 bis 50 Stöße erfordern kann. Wir können die vollständige Homogenisierung überprüfen, indem wir ein Aliquot der DOD-Zellen mit Trypanblau färben und unter einem Lichtmikroskop betrachten. Es sollte etwa so aussehen.Dies ist die erste Probe nach 50 Stößen mit einem Down. Dies ist die zweite Probe nach 80 Stößen mit einem Down. Sobald die Zellen homogenisiert sind, zentrifugieren Sie sie bei 20.000 ×g für 10 Minuten bei vier Grad C. Dies liefert uns ein rohes mitochondriales Pellet, das auch Kerne und größere Zellfragmente enthält.Vor der Sammlung des Pellets muss das Sammelröhrchen gewogen werden, um das anschließende Pelletgewicht zu bestimmen, der Überstand abgegossen und verworfen werden, und anschließend das präzipitierte, rohe mitochondriale Pellet gewogen werden. Indem man zu diesem Zeitpunkt das Gewicht des Röhrchens subtrahiert, kann man mit der Auflösung des Pellets fortfahren, was im nächsten Schritt gezeigt wird. Um das rohe mitochondriale Pellet aufzulösen, beginnen wir damit, das Pellet auf Eis zu lagern und mit 35 µL eiskaltem Solubilisierungspuffer zu vortexen.Für jeweils 20 Milligramm Pellet, zu denen detaillierte Angaben über die Pufferzusammensetzung im beigefügten schriftlichen Protokoll enthalten sind. Nach dem Wirbeln und Zugabe des Solubilisierungspuffers, aber vor der Zugabe von Digitonin, überführen wir den resuspendierten Pellet in ein für Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeignetes Röhrchen und geben anschließend 20 Mikroliter 10 %iger (Gewicht pro Volumen) Digitonin-Lösung pro 20 Milligramm Pelletmasse hinzu. Nach dem Mischen durch vorsichtiges Anstupsen des Röhrchens wird der mitochondriale Pellet gründlich vermischt und für fünf bis zehn Minuten auf Eis inkubiert. Doil-beta-D-Multisid oder DDM beziehungsweise Triton X-100 können als Alternative zu Digitonin zur Proteinsolubilisierung verwendet werden.Die Wahl des Detergens und dessen Menge kann die Bildung supramolekularer Komplexe oder multimerer Formen mitochondrialer Komplexe nach der Inkubation auf Eis beeinflussen. Und sobald das Pellet solubilisiert wurde, zentrifugieren wir es bei hunderttausend ×g für 15 Minuten bei vier Grad C und sammeln anschließend den klaren Überstand. Nun sind wir bereit, den Überstand für den Lauf in unserem Gradientengel vorzubereiten, um eine native Gradientengelelektrophorese von Mitochondrien durchzuführen.Es wird empfohlen, ein Acrylamid-Gradienten-Gel von fünf bis 13 % mit einem 3,5 %igen Übertragergel zu verwenden. Zur Herstellung des Gels verwenden wir eine Acrylamid-Bis-Acrylamid-Mischung, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Die Acrylamid-Bis-Acrylamid-Lösung wird im Voraus hergestellt und bei vier Grad Celsius an einem dunklen Ort aufbewahrt.Acrylamid und Bis-Acrylamid sind toxische Chemikalien, sowohl als Pulver als auch in flüssiger Form, weshalb besondere Vorsicht geboten ist, wenn mit ihnen gearbeitet wird. Wir kombinieren die Acrylamid-Bis-Acrylamid-Lösung mit einem Aliquot aus einem dreifachen Gel-Puffer, der aus 1,5 Molar 6-Aminohexansäure und 75 Millimolar Ole bei pH 7,0 besteht. Die Menge an Acrylamid-Bis-Acrylamid-Lösung, die wir dem Puffer hinzufügen, hängt vom gewünschten Prozentsatz des Gels ab, um das Gradientengel herzustellen.Wir stellen eine 4 %ige Mischung und eine 13 %ige Mischung her, und das Stapelgel wird eine 3,5 %ige Mischung sein. Vergessen Sie nicht, der 13 %igen Mischung Glycerin hinzuzufügen. Wenn alle drei Mischungen bereit sind, geben wir eine geeignete Menge Ammoniumpersulfat und TEMED zu den Mischungen hinzu und füllen die Mischungen in eine Gelperfusionskammer für Gradienten.Der linke Teil der Kammer enthält das 5%ige Gemisch. Der rechte Teil der Kammer enthält das 13%ige Gemisch zusammen mit einem kleinen magnetischen Rührstab. Wir beginnen, das Gel einzugießen, indem wir den rechten Teil der Kammer öffnen.Dann öffnen wir umgehend den linken Teil der Kammer und lassen die 5%-Lösung mit einer 13%-Lösung vermischen, um den Gradienten zu erzeugen. Wir geben eine kleine Menge Isopropanol auf die Oberseite des Gels, um nach der Polymerisation eine scharfe, gerade Grenzfläche des Gels zu bilden. Etwa eine Stunde später, wenn die Polymerisation des Gradientengels abgeschlossen ist, entfernen wir das Isopropanol und geben das 3,5%-Stapelgel in die Apparatur, anschließend setzen wir einen Kamm ein.Wir werden die Gele in einem Kühlraum mit einer Temperatur von etwa vier bis sieben Grad Celsius zusammenbauen und laufen lassen. Für den Lauf dieses Gels verwenden wir zwei verschiedene Puffer. In der Anodenkammer setzen wir einen Puffer ein, der 25 Millimolar Ole-Hydrochlorid-Puffer, pH 7,0, enthält.Der Kathodenpuffer enthält 50 Millimolar Tric, 7,5 Millimolar Ole-Hydrochlorid, 0,02 % Gewicht pro Volumen Doil-Beta-D-Multisid oder DDM und 0,05 % Gewicht pro Volumen Deoxycoat, pH 7,0. Um das Supernatant vorzubereiten, das in das soeben gegossene Gel eingebracht wird, wird Lade-Puffer hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 5 % Gewicht pro Volumen Glycerin und 0,01 % Gewicht pro Volumen Ponto S zu erreichen. Üblicherweise geben wir eine 10×-Stammlösung, die Glycerin und Poncho S enthält, direkt zu den Supernatants.Nun sind wir bereit, die Proben auf das Gel aufzutragen. Wir beladen die Gelltaschen mit einem Volumen, das 20 bis 40 Milligramm des rohen mitochondrialen Proteins pro Lane enthält. Unmittelbar nach dem Beladen wird das Gel bei 100 Volt durchlaufen.Wenn die Probe in das Stapelgel eingetreten ist, kann die Spannung auf 500 Volt erhöht werden, wobei der Strom auf 15 Milliampere begrenzt bleibt. Obwohl wir das Gel normalerweise über Nacht bei 70 bis 100 Volt laufen lassen, beenden wir die Elektrophorese, sobald sich eine scharfe Linie des roten Zos-Farbstoffs der Vorderkante des Gels nähert. Nachdem das Gel durchgelaufen ist, können wir die Aktivität der verschiedenen Protein-Komplexe direkt im Gel analysieren.Die Inkubationszeit für jeden Assay hängt von der Effizienz der Proteinsolubilisierung und der Menge des pro Wellen eingebrachten Materials ab. Komplex 1, 4 und 5 erzeugen gewöhnlich stärkere Signale als Komplex 2 und 3. Aus diesem Grund sollte die Färbezeit für Komplex 2 und 3 länger sein.Um die Aktivität der Komplexe zu testen, müssen wir spezifische Puffer für jeden Komplex verwenden. Die Bestandteile der einzelnen Puffer finden Sie im schriftlichen Protokoll. Nun schneiden wir die einzelnen Gelläden aus, um die In-Gel-Aktivitätsanalysen separat durchzuführen.Für alle Komplexe inkubieren Sie den Gelausschnitt mit Ausnahme von Komplex fünf mehrere Stunden bei Raumtemperatur in den jeweiligen Puffern. Nach der Inkubation fixieren Sie das Gel 15 bis 45 Minuten lang in 50 % Methanol und 10 % Essigsäure. Das fixierte Gel wird in 10 % Essigsäure aufbewahrt.Sie sehen hier, wie die Färbung des Komplexes I erscheint. Es gibt ein tiefviolett gefärbtes Band im Gelschnitt, das dem Komplex I entspricht. Klare Gele ermöglichen die Densitometrie der mitochondriale Komplexe und vergleichende Analysen.Nach der dichten Zytometrie trocknen wir die Gele oft zur Langzeitlagerung und/oder zum Scannen, um ein hochwertiges Bild zu erhalten. Zwei Komplexe färben sich dabei in derselben violetten Farbe, nämlich Komplex drei und Komplex vier. Beide zeigen ein orange- oder gelblich gefärbtes Band. Hier sind Beispiele für die Färbeaktivitäten von Komplex zwei, drei und vier.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Aktivität von mitochondrialen Exsudat-Ations-Komplexen analysiert, die aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnen und mittels hochauflösender nativer Gelelektrophorese getrennt wurden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Forschung

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Biologie

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Einzelzell-Genexpression Test wird für das Verständnis der Stammzell Heterogenitäten benötigt.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Hier skizzieren wir, wie man die mitochondriale Lokalisation einer (Zellzyklus-)Kinase untersucht und wie man ihre submitochondriale Position sowie potenzielle mitochondriale Substrate/Ziele bestimmt. Die erzwungene Expression von Proteinen in die Mitochondrien stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die funktionellen Konsequenzen der mitochondrialen Lokalisierung eines Proteins von Interesse zu untersuchen.

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das vorgestellte Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Vorhirn-Neuronen, um mitochondrialen Transport und Morphologie bei erblicher spastischer Paraplegie zu bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie, die das Studium neurodegenerativer Erkrankungen...

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hirnorganoiden und deren Verwendung bei der Modellierung mitochondrialer Erkrankungen.

Generierung menschlicher Gehirnorganoide für die mitochondriale Krankheitsmodellierung

Die Aufbereitung von mit Mitochondrien angereicherten Proben aus zuvor gefrorenem archiviertem festem Gewebe ermöglichte es den Forschern, sowohl funktionelle als auch analytische Bewertungen von Mitochondrien in verschiedenen experimentellen Modalitäten durchzuführen. Diese Studie zeigt, wie man mit Mitochondrien angereicherte Präparate aus gefrorenem Herzgewebe herstellt und analytische Bewertungen von Mitochondrien durchführt.

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Analyse von respiratorischen Superkomplexen, wenn nur geringe Mengen an Proben zur Verfügung stehen.

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben 

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Erfahren Sie die Analyse mitochondrialer Atmungskettenkomplexe in humanen embryonalen Stammzellen mittels In-Gel-Aktivitätsassays. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Stammzellbiologie.

Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

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