Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

Mitochondrien Spielen zahlreiche Rollen in der Zellphysiologie, vom Stoffwechsel und der Energieproduktion über das Programm des Zelltods bis hin zur Steroidhormonsynthese. Trotz der Bedeutung der Mitochondrien sowohl für die grundlegenden zellulären Funktionen als auch für die Krankheit ist nur sehr wenig über die Funktion der Mitochondrien in menschlichen embryonalen Stammzellen und ihren differenzierten Nachkommen bekannt. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die Mitochondrien-Atmungskettenkomplexe von humanen Amry-Stammzellen mit Hilfe von Ingel-Aktivitätsassays analysiert werden können.

Hallo, ich bin Ivan OV aus dem Labor von Michael Tetel in der Abteilung für Pathologie und Labormedizin an der University of California Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Beurteilung der Funktion des mitochondrialen Atmungskomplexes in menschlichen embryonalen Stammzellen. Dieses Verfahren umfasst die Isolierung des rohen mitochondrialen Gaumens aus menschlichen embryonalen Stammzellen, die Trennung von mitochondrialen Komplexen des exsudativen Phosphorylierungssystems mit einer klareren nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit höherer Auflösung und die anschließende In-Gel-Aktivität sa.

Also lasst uns loslegen. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, Mitochondrien aus menschlichen embryonalen Stammzellen zu isolieren. Für diesen Assay verwenden wir menschliche embryonale Stammzellen, die auf einer mit Matrigel bedeckten Platte in einem feederfreien Zustand gezüchtet wurden.

Um Mitochondrien aus unseren menschlichen Amry-Stammzellen zu gewinnen, waschen wir sie zunächst mit warmem XPDS pH 7,4 und trypsin die Zellen dann fünf Minuten lang. Sie können eine Mil von einem x Trypsin pro Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen verwenden. Nach fünf Minuten können Sie die Reaktion stoppen, indem Sie ein gleiches Volumen an frischem Trypsin-Inhibitor ein Milligramm pro Monat in einem XPBS hinzufügen und die Zellen ernten.

Die gesammelten Zellen werden dann bei 200-facher G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Schleudern den Überstand und die Wiederbelebung verwerfen, die pelletierten Zellen in 0,8 bis 1,7 Milliliter eiskaltem Mitochondrien-Isolationspuffer mit einem frisch zubereiteten Cocktail aus einem x Proteasehemmer suspendieren. Wie viel Puffer Sie verwenden, hängt von der Größe des Zellpellets ab, das Sie erhalten. Nachdem das Pellet resuspendiert wurde, inkubieren Sie es etwa 10 Minuten lang auf Eis.

Nach der Inkubation auf den Zellen werden die Zellen mit einem Homogenisator abgeführt, was etwa 40 bis 50 Hübe dauern kann. Wir können die vollständige Liste der Homogenisierung überprüfen, indem wir ein Aliquot der DOD-Zellen mit Trianblau färben und durch ein Lichtmikroskop schauen. Es sollte in etwa so aussehen.

Dies ist der erste Schlag nach 50 Schlägen mit einem Downs. Dies ist der zweite Schlag nach 80 Schlägen mit einem Downs. Sobald die Zellen homogenisiert sind, zentrifugieren Sie sie bei 20.000 Mal G für 10 Minuten bei vier Grad C. Dadurch erhalten wir ein rohes mitochondriales Pellet, das auch Kerne und größere Zellfragmente enthält.

Vor der Entnahme des Pellets müssen wir das Sammelrohr wiegen, um das spätere Pelletgewicht abzuschätzen, den Überstand ausgießen und verwerfen und dann das ausgefällte rohe mitochondriale Pellet wiegen. Indem man an dieser Stelle das Gewicht des Rohrs abzieht, kann man mit der Solubilisierung des Pellets fortfahren, was im nächsten Schritt gezeigt wird. Um das rohe mitochondriale Pellet zu lösen, beginnen wir damit, das Pellet auf Eis zu halten und mit 35 Mikrolitern eiskaltem Solubilisierungspuffer zu vertexen.

Für jeweils 20 Milligramm Pellet, die wir haben, werden detaillierte Informationen über die Pufferverbindungen im begleitenden schriftlichen Protokoll erwähnt. Nach dem Vortexen und der Zugabe von Solubilisierungspuffer und vor der Zugabe von digit toin überführen wir das resuspendierte Pellet in ein Röhrchen, das für die Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeignet ist, und fügen dann 20 Mikroliter mit 10 % Gewicht pro Volumen digit toin für 20 Milligramm Pelletgewicht hinzu und mischen durch Schnippen des Röhrchens, nachdem es gründlich gemischt wurde, inkubieren Sie das mitochondriale Pellet fünf bis 10 Minuten lang auf Eis. Doil beta D multiside oder DDM oder Triton X 100 können anstelle von digit toin zu solubilisierten Proteinen substituiert werden.

Die Wahl des Detergens und seiner Menge kann die Bildung von Suprakomplexen oder multimeren Formen von mitochondrialen Komplexen nach der Inkubation auf Eis beeinflussen. Und sobald das Pellet löslich ist, zentrifugieren wir es 15 Minuten lang bei einem hunderttausend Mal G bei vier Grad C und sammeln dann den klaren Überstand. Wir sind nun bereit, den Überstand für den Betrieb auf unserem Gradientengel für die native Gradientengelelektrophorese der Mitochondrien vorzubereiten.

Wir empfehlen die Verwendung eines Acrylamid-Gradientengels von fünf bis 13 % mit einem 3,5 %-Stapelgel. Zur Herstellung des Gels verwenden wir eine Acrylamid-bis-Acrylamid-Mischung, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Acrylamid bis Acrylamid Lösung wird im Vorfeld hergestellt und bei vier Grad Celsius an einem dunklen Ort gelagert.

Acrylamid und Bisacrylamid sind giftige Chemikalien, sowohl in pulverförmiger als auch in flüssiger Form, daher sollte bei der Arbeit mit ihnen besondere Vorsicht geboten sein. Wir kombinieren die Acrylamid-bis-Acrylamid-Lösung mit einem Aliquot aus drei x Gelpuffer, bestehend aus 1,5 molaren sechs Aminohexansäure und 75 Millimolar ol bei pH 7,0. Die Menge an Acrylamid bis Acrylamidlösung, die wir dem Puffer hinzufügen, hängt von dem Prozentsatz des Gels ab, den wir herstellen, um das Gradientengel herzustellen.

Wir machen einen 4%-Mix und einen 13%-Mix, und das Stapelgel wird ein 3,5%-Mix sein. Vergessen Sie nicht, dem 13%-Mix Glycerin hinzuzufügen. Wenn alle drei Mischungen fertig sind, fügen wir den Mischungen eine angemessene Menge Ammonium pro Sulfat und Temid hinzu und gießen die Mischungen in eine Gradientenformer-Gießkammer.

Im linken Teil der Kammer befindet sich die 5%-Mischung. Der rechte Teil der Kammer enthält die 13%-Mischung in einem kleinen Magnetrührstab. Wir beginnen mit dem Eingießen des Gels, indem wir den rechten Teil der Kammer öffnen.

Dann öffnen wir sofort den linken Teil der Kammer und lassen die 5%ige Lösung mit einer 13%igen Lösung mischen, um den Gradienten zu erzeugen. Wir fügen eine kleine Menge Isopropanol auf die Oberseite des Gels hinzu, um nach der Polymerisation einen scharfen, geraden Rand für das Gel zu bilden. Etwa eine Stunde später, wenn die Polymerisation des Gradientengels abgeschlossen ist, entfernen wir das Isopropanol und gießen das 3,5-Stapelgel in die Apparatur und führen einen Gelkamm ein.

Wir werden die Gele in einem Kühlraum von etwa vier bis sieben Grad Celsius zusammensetzen und laufen lassen. Um dieses Gel auszuführen, verwenden wir zwei verschiedene Puffer. In der Anodenkammer verwenden wir einen Puffer mit 25 Millimolar Ölsalzsäure pH 7,0.

Der Kathodenpuffer enthält 50 Millimeter tric, 7,5 Millimolare Ölsalzsäure, 0,02 % Gewicht pro Volumen, Doil Beta D Multiside oder DDM und 0,05 % Gewicht pro Volumen, Desoxycoate pH 7,0. Um den Überstand für das soeben gegossene Gel vorzubereiten, wird Ladepuffer hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 5 % Gewicht zu Volumen Glycerin und 0,01 % Gewicht zu Volumen zu erhalten. Ponto S fügen wir in der Regel eine 10-fache Stammlösung hinzu, die Glycerin und Poncho S enthält, direkt zu den Überständen.

Jetzt sind wir bereit, die Gelprobe auf das Gel zu laden. Wir werden die Gel-Wells mit einem Volumen bestücken, das 20 bis 40 Milligramm des mitochondrialen Rohproteins pro Bahn enthält. Unmittelbar nach dem Laden wird das Gel mit 100 Volt betrieben.

Sobald die Probe in das Stapelgel gelangt ist, kann die Spannung auf 500 Volt erhöht werden, wobei der Strom auf 15 Milliampere begrenzt ist. Obwohl wir das Gel normalerweise über Nacht bei 70 bis 100 Volt laufen lassen, stoppen wir die Elektrophorese, wenn sich eine scharfe Linie des roten Zos-Farbstoffs der Gelfront nähert. Nachdem das Gel nun ausgeführt wurde, können wir die Aktivität verschiedener Proteinkomplexe direkt im Gel analysieren.

Die Inkubationszeit für jeden Assay hängt von der Effizienz der Proteinsolubilisierung und der Menge des pro Well geladenen Materials ab. Die Komplexe eins, vier und fünf liefern in der Regel stärkere Signale als die Komplexe zwei und drei. Aus diesem Grund sollte die Färbezeit für die Komplexe zwei und drei länger sein.

Um die komplexe Aktivität zu testen, müssen wir für jeden Komplex spezifische Puffer verwenden. Die Inhaltsstoffe für die einzelnen Puffer finden Sie im schriftlichen Protokoll. Nun schneiden wir einzelne Spuren des Gels aus, um die Ingel-Aktivitätsassays separat durchzuführen.

Inkubieren Sie die Gelscheibe für alle Komplexe mit Ausnahme von Komplex fünf für alle Komplexe mit Ausnahme von Komplex fünf mehrere Stunden lang bei Raumtemperatur in ihren jeweiligen Puffern. Fixieren Sie das Gel nach der Inkubation 15 bis 45 Minuten lang in 50 % Methanol und 10 % Essigsäure. Das fixierte Gel wird in 10%iger Essigsäure konserviert.

Sie sehen hier, wie die Färbung des Komplexes eins aussieht. In der Gelscheibe befindet sich ein tiefviolettes Band, das dem komplexen Band entspricht. Mit klaren Gelen können Sie Densitometrien von mitochondrialen komplexen Aktivitäten durchführen und vergleichende Analysen durchführen.

Nach der dichten Zytometrie trocknen wir die Gelscheiben in der Regel zur Langzeitlagerung und/oder zum Scannen, um einen qualitativ hochwertigen Bildkomplex zu erhalten, zwei Färbungen in der gleichen violetten Farbe wie ein Komplex drei und komplex vier. Beide ergeben ein orangefarbenes oder gelbliches Färbeband. Hier sind Beispiele für komplexe zwei-, drei- und vierfache Färbeaktivitäten.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Aktivität von mitochondrialen exsudativen Ationskomplexen analysieren können, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen extrahiert und durch eine höhere Auflösung getrennt wurden, einschließlich nativer Gelelektros. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.