Name: Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus der Mausplazenta für Entwicklungsbiologie. Diese Methode zeigt einzigartige Nischen zur Visualisierung und Analyse von HSCs während der Embryogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Embryo und Plazenta Entfernung Dissektion <ol><li> Um zu beginnen, müssen Embryonen zunächst von schwangeren Muttertiere isoliert werden. </li><li> Die Tiere sind gemäß den vereinbarten Verfahren eingeschläfert - in unserem Fall werden wir eine tödliche Dosis des Anästhetikums Isofluran verwenden </li><li> Zuerst sprühen den Bauch mit Ethanol und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere. </li><li> Losreißen die Haut mit beiden Händen auf den Bauch aufzudecken und aufgeschnitten das Bauchfell. </li><li> Mit Pinzette, nehmen Sie den Uterushörner und sammeln sie mit einer Schere an jedem distalen Ende. Legen Sie die Uterushörner in eine Petrischale mit PBS und auf Eis gefüllt. Denken Sie auch daran, mehrmals mit PBS waschen, bevor die Isolierung des Plazenta. Wir können nun isolieren die Plazenta. </li><li> Mit zwei Zangen, beginnen vorsichtig Abziehen der Endometrium-Gewebe rund um den Embryo conceptuses. Man sollte darauf achten, nicht zu durchstechen oder anderweitig zufügen strukturelle Schäden an den Embryonen, da diese nachfolgenden Schritte Dissektion erschweren wird. </li><li> Legen Sie die isoliert conceptuses in eine neue Petrischale mit PBS auf Eis und weiter, bis alle conceptuses aus dem Endometrium befreit worden wären. </li><li> Transfer ein conceptus, um eine neue Petrischale mit PBS unter dem Mikroskop und mit zwei Pinzetten schälen decidua weg von der Plazenta gelegt. Entfernen Sie so viel von der Dezidua wie möglich Deciduazellen wird mit Einzel-Zell-Suspension und Durchflusszytometrie stören. Eine glatte kontinuierliche Peeling Bewegung wird empfohlen, die besten Ergebnisse zu erzielen. </li><li> Cut der Dottersack weg von der Plazenta an der Kreuzung zwischen den beiden Organen und ziehen Sie den Dottersack und Dotter-Schiffe weg von der Plazenta. Es sollte darauf geachtet werden, dass der Chorionplatte der Plazenta stören, vor allem mit frühen Embryonen werden. </li><li> Vorsichtig hält die Chorionplatte der Plazenta mit einer Pinzette und die Nabelschnur mit einem anderen, ziehen die Nabelschnur und die angeschlossenen Embryo weg von der Plazenta. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Riesenzelle Gewebe an den Rändern der Plazenta, um Zellen verklumpen während der Vorbereitung von Einzel-Zell-Suspension zu minimieren. </li><li> Sammeln Sie die Plazenta in einen geeigneten Behälter, wie ein 15-ml-Falcon-Röhrchen mit PBS +5% FCS und auf Eis. Tun Sie dies für alle Plazenten seziert. </li><li> An dieser Stelle können Sie entweder mit der Vorbereitung der Ein-Zell-Suspension für die Durchflusszytometrie, funktionelle Assays, wie in vitro-Kultur oder Transplantation gehen, oder bereiten ganze Plazenta für die Gewebe-Fixierung und festen gefrorenen Block Einbettung für eventuelle Immunhistochemie. </li></ol> 2. Erstellung von Einzel-Zellsuspension von Placentagewebe <ol><li> Wir werden nun zeigen, wie eine einzige Zellsuspension aus Plazenta für FACS-Analyse erstellt werden soll. </li><li> Zur Vorbereitung einer Zellsuspension aus Plazenta, mechanische und enzymatische Dissoziation ist nicht erforderlich. Bereiten Sie zunächst die 0,1% Collagenase-Lösung in PBS mit 10% FCS und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung. </li><li> Fügen Sie ein geeignetes Volumen von Kollagenase Lösung der Plazenta, je nachdem, wie viele Sie haben. Ein Volumen, das zweimal die Plazenta Volumen und zwischen 2-5ml wird empfohlen. </li><li> Verwenden Sie eine 16-G-Nadel auf einer 5-ml-Spritze mechanisch stören das Gewebe durch Passagieren die Collagenase-Lösung und der Plazenta durch die Nadel 3 mal angebracht. Wiederholen Sie mit einem 18-G-Nadel. </li><li> Legen Sie die Probe in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 45 Minuten. </li><li> Nach der 45 minütigen Inkubation in Kollagenase, Passage der Zell-Lösung durch eine 20-G-Nadel, und Inkubation für weitere 45 Minuten, in 37 ° C. </li><li> Nach dem 1,5 Std. insgesamt Inkubation in Kollagenase, Passage der Zell-Lösung durch 22-G und 25-G Nadeln 3-mal mit jeder Nadel. </li><li> Filtern Sie die Probe durch eine 50-um-Filter angebracht, um eine neue 15-ml-Falcon-Röhrchen mit PBS +5% FCS und Zentrifuge Waschen bei 4 ° C für 5 Minuten bei 300 × g. </li><li> An dieser Stelle haben wir eine einzelne Zellsuspension für FACS-Analyse oder funktionellen Assays. </li></ol> 3. Tissue Fixation für Gefrierschnitte <ol><li> Direkt nach dem Freischalten der Plazenta von jedem Embryo, sind sie in kaltem 1X PBS gelegt. Normalerweise wird eine 96-Well-Platte funktioniert am besten für junge Plazenten (E8.5-11.5), sondern mit älteren Plazenten, E12.5 und älter, eine 24-Well-Platte ist zwar recht praktisch. </li><li> Jede Plazenta ist in eine neue, gut gefüllt mit frisch aufgetauten 4% paraformaldahyde oder PFA übertragen. Für die E12.5 Plazenten, wird das Gewebe um einen neuen Brunnen von Hand bewegt, aber für die E10.5 können Sie die PBS vorsichtig mit einer Pipette und fügen Sie die PFA. Es ist wichtig, dass die Plazenta vollständig für 2-4 Stunden bei 4 ° C getaucht, je nach Alter und Größe des Gewebes. </li><li> Übertragen Sie die Gewebe in 30% Saccharose, oder wenn das Gewebe sehr klein und zerbrechlich sind, saugen Sie den PFA und fügen Sie die Saccharose direkt. In diesem Stadium wird die Plazenta in Lösung zu schweben. Lassen Sie das Gewebe bleiben über Nacht bei 4 ° C.</li><li> Nach der Übernachtung Schritt in 30% Saccharose, sollte das Gewebe schließlich auf den Grund des Brunnens, bezeichnend für richtige Kryokonservierung sinken. Entfernen Sie die Hälfte der Saccharose-Lösung und setzen Sie die Lautstärke mit OCT und Ort des Gewebes wieder in 4 ° C für 1-2 Stunden. Dies erleichtert Oktober Penetration. </li><li> Transfer des Gewebes auf 100% OCT für 1 Stunde, nach dem sie eingebettet werden können. </li></ol> 4. Die Einbettung der fixierten Gewebe <ol><li> Label Kunststoffformen mit entsprechenden Gewebe-Identifikation (Karte B. Schimmel). </li><li> Ziehen Sie das Gewebe von der OCT-Lösung und schneiden die Plazenta in der Hälfte durch die Ausrichtung der scheibenförmigen Plazenta mit der Nabelschnur nach unten und sorgfältig Schneiden mit einer Rasierklinge achten Sie darauf, die Klinge hin und her bewegen, bevor die Freigabe Druck, um sicherzustellen, ein noch geschnitten. Die Plazenta ist in zwei Hälften geschnitten, um die besten prientation erreichen später visualisieren die Plazenta HSK. </li><li> Legen Sie eine Plazenta Hälfte bei den Boden der Form mit der Schnittkante in Kontakt mit der Bodenfläche der Form. Wiederholen Sie mit einem neuen Werkzeug für die andere Hälfte. Für E10.5 Plazenten, können beide Hälften in der gleichen Form mit der gleichen Technik angebracht werden. </li><li> Beim Eingießen ÜLG in der Form, kann es schwierig sein, die Plazenta in die richtige Orientierung zu behalten. Sichern Sie die Plazenta statt, indem das Gewebe zur Hälfte mit einer Pinzette. Langsam pour Oktober-Lösung in der Form und vermeiden jegliche Blasen. Für E10.5 Plazenten, halten einem Gewebetyp Hälfte von Pinzette und Ruhe der anderen Gewebe Hälfte gegen die Außenseite der Pinzette. Langsam pour Oktober Lösung für E12.5 Plazenten beschrieben. </li><li> Sobald die Form mit OCT gefüllt ist, schnell Platz die Form auf Trockeneis, wird der OCT wiederum weißen Blitz Einfrieren des Gewebes </li><li> Legen Sie die Form in einen kleinen Plastikbeutel mit Drierite und sofort in den -80 ° C Gefrierschrank lagern. </li></ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wird für die Isolierung und die Visualisierung von Plazentagewebe und hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen zu ermöglichen. Für einen umfassenden Überblick über erwartete zellulären Ertrag und Anzahl der HSZ in Plazenta und anderen fetalen blutbildenden Organe während der fetalen Entwicklung verweisen wir auf Gekas, et al. 2005. Für die Lokalisierung der Entwicklung von Blutstammzellen und anderen hämatopoetischen Zellen in der Plazenta verweisen wir auf Rhodos, et al. 2008.

Material-Liste: 100 mM Glucose 10 mM NaN3 15-ml konische Röhrchen (BD) 16-G, 18-G, 20-G, 22-G und 25-G-Nadeln (BD) 30% Saccharose-Lösung 35mm Petrischalen (BD) 4% Paraformaldehyd 50 - m-Zelle Filter (Celltrics) 5-ml-Spritzen (BD) Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector) Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector) Antibiotika (Penicillin / Streptomycin, P / S)-Lösung Collagenase Typ I (Sigma) Cryomold Einweg-Vinyl Specimen-Formen (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Cytokeratin Primäre Antikörper (DakoCytomation) Dissektionszangen, Edelstahl oder Titan, Nummer 5 oder 55 Drierite Fetal Bovine Serum (FBS) Fisherbrand Plastic Objektträger Mailer (Fisher) Glucose-Oxidase 1000u/ml Levamisol (Vector) Montage Medien auf wässriger Basis Eindeckmedium (VectamountTM AQ) Normalem Pferdeserum (Vector) Optimal Cutting Temperature (OCT, Tissue-Tek) Peroxidasesubstrat Kit DAB (Vector) Phosphate Buffered Saline (PBS) mit Calcium / Magnesium (w Ca2 + / Mg2 +) Phosphate Buffered Saline (PBS) ohne Calcium / Magnesium (w / o Ca2 + / Mg2 +) Plastic Slide Box (hält 100 Dias) Kunststoffschlauch (Nalgene 180 PVC Ungiftig autoklavierbar) Polypropylen Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinase K 20mg/ml Lösung (Amresco) Research Products International Corp Super-Pap Pen HT * Slide Marker (2,5 mm, Fisher) Tissue-Kultur behandelt U-förmig (Rundboden) 96-gut-oder 24-Well-Platten (BD Falcon) Tween20, SigmaUltra (Sigma) Tyramid Amplification Kit (Invitrogen) Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector) Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)

isolierung und analyse von hämatopoetischen stammzellen aus der plazenta

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) haben die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und generieren alle Zelltypen des Blutes Linien über die gesamte Lebensdauer eines Individuums. Alle HSCs entstehen während der embryonalen Entwicklung, nach denen ihre Pool-Größe durch sich selbst erneuernden Zellteilungen wird beibehalten. Die Ermittlung der anatomischen Ursprung der HSC und die kritische Entwicklungsschritte regulieren den Prozess der HSC Entwicklung wurde kompliziert, wie viele anatomische Sites während der fetalen Hämatopoese beteiligt. Kürzlich haben wir festgestellt, die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ, in dem HSC generiert und erweitert in einmaliger Mikroumgebung Nischen (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Folglich ist die Plazenta eine wichtige Quelle für Blutstammzellen bei ihrer Entstehung und erste Expansion. In diesem Artikel zeigen wir Dissektion Techniken zur Isolierung von murinen Plazenta von E10.5 und E12.5 Embryonen, entsprechend der Entwicklungsstadien der Einleitung von HSK und die Spitze in der Größe der HSC-Pool in der Plazenta, bzw.. Darüber hinaus präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die enzymatische und mechanische Dissoziation von Plazentagewebe in den Single-Zell-Suspension für den Einsatz in der Durchflusszytometrie oder funktionellen Assays. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung von Kollagenase für Einzel-Zell-Suspension der Plazenta auskömmlichen Renditen von HSK gibt. Ein wichtiger Einflussfaktor HSC Ertrag aus der Plazenta ist der Grad der mechanischen Dissoziation vor, und die Dauer der, enzymatische Behandlung. Wir bieten auch ein Protokoll für die Herstellung von festen gefrorenen Plazentagewebe Abschnitte für die Visualisierung der Entwicklung von Blutstammzellen durch Immunhistochemie in ihrer genauen zellulären Nischen. Als hämatopoetischen spezifische Antigene nicht während der Herstellung der in Paraffin eingebetteten Abschnitte erhalten sind, verwenden wir routinemäßig fixiert Gefrierschnitten für die Lokalisierung der Plazenta HSCs und Vorläuferzellen.

Wir haben die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ während der Entwicklung identifiziert. Wir fanden, dass hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind beide generiert und erweitert in der Plazenta in einzigartige Mikroumgebung Nischen. Hier beschreiben wir experimentelle Techniken zur Isolierung und Visualisierung von HSZ in der Maus Plazenta erforderlich.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und zur Generierung aller Zelltypen der Blutlinien über die gesamte Lebensspanne eines Individuums hinweg. ...

Hallo, ich bin Mikkola und begrüße Sie in meinem Labor. Der primäre Schwerpunkt unseres Labors liegt in der Erforschung der Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen. Während der Embryogenese haben wir die Plazenta als ein wichtiges hämatopoetisches Organ identifiziert und festgestellt, dass hämatopoetische Stammzellen in einzigartigen mikroumgebungsabhängigen Nischen sowohl in der Plazenta erzeugt als auch expandiert werden.Daher besitzt die Plazenta einen enormen Wert als Quelle hämatopoetischer Stammzellen während ihres Auftretens und der anfänglichen Expansion. Heute werden die Mitglieder meines Labors die experimentellen Techniken vorführen, die zur Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus der Plazenta und zur Visualisierung von HCS in ihren einzigartigen mikroumgebungsbedingten Nischen erforderlich sind. Hallo, ich bin Chriss Geka aus dem Labor von Dr. Hannah Mola am Department für Molekulare Zell- und Entwicklungsbiologie an der UCLA.Heute zeige ich Ihnen, wie man die Mausplazenta disseziert und wie man eine Einzelzell-Suspension aus Plazentagewebe für die FACS-Analyse fetaler hämatopoetischer Stammzellen herstellt. Ich bin Katrina Rhodes und zeige Ihnen, wie man Plazentagewebe für die Immunhistochemie vorbereitet. Beginnen wir also.Zunächst müssen Embryonen aus trächtigen Weibchen isoliert werden. Die Tiere werden gemäß genehmigter Verfahren euthanasiert. In unserem Fall verwenden wir eine tödliche Dosis des Anästhetikums Isofluran.Zuerst den Bauch mit Ethanol besprühen und mit einer Schere einen kleinen Einschnitt machen. Die Haut mit beiden Händen zurückziehen, um den Bauch freizulegen, und das Peritoneum mit einer Pinzette öffnen. Die Uterushörner anheben und an jedem distalen Ende mit der Schere entfernen.Legen Sie die Uterushörner in eine Petrischale, die mit PBS gefüllt ist, und stellen Sie sie auf Eis. Denken Sie auch daran, mehrmals mit PBS zu waschen, bevor Sie die Plazenta mit zwei Pinzetten isolieren. Beginnen Sie vorsichtig, das das Embryonalgebilde umgebende Endometriumgewebe abzulösen.Diese Embryonen stammen vom embryonalen Tag 12,5, dem Entwicklungszeitpunkt, zu dem sich hämatopoetische Stammzellen oder HSCs in der Plazenta in ihrer höchsten Zahl befinden. Man sollte darauf achten, die Embryonen nicht zu durchstechen oder anderweitig strukturelle Schäden zuzufügen, da dies nachfolgende Dissektionsschritte erschweren würde. Legen Sie die isolierten Embryonen in die neue Petrischale mit PBS auf Eis und setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Embryonen vom Endometrium gelöst wurden.Übertragen Sie einen Embryo in die neue Petrischale mit PBS, die unter dem Mikroskop platziert ist. Lösen Sie mit zwei Pinzetten die Deidra von der gelben Plazenta ab. Entfernen Sie so viel wie möglich von der Deidra, da Deidra-Zellen stören können.Bei Einzelzell-Suspension und Durchflusszytometrie wird eine gleichmäßige, kontinuierliche Schälbewegung empfohlen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Zu beachten ist, dass bei jüngeren Embryonen wie diesen Embryonen vom embryonalen Tag 10,5 oder E 10,5 das Deidra den gesamten Keimkomplex umgibt.Im Gegensatz zu E12,5-Embryonen beginnen HSCs bei E10,5 gerade erst in der Plazenta zu entstehen. Achten Sie auf den erheblichen Größenunterschied zwischen E10,5- und E12,5-Embryonen. Trennen Sie das Dottersack von der Plazenta an der Verbindungsstelle zwischen den beiden Organen und ziehen Sie vorsichtig den Dottersack und die darin verlaufenden Blutgefäße von der Plazenta ab.Es sollte darauf geachtet werden, die Chorionplatte der Plazenta nicht zu beschädigen, insbesondere bei frühen Embryonen. Halten Sie die Chorionplatte der Plazenta vorsichtig mit einer Pinzette fest, während Sie den Nabelstrang mit einer weiteren Pinzette greifen. Lösen Sie den Nabelstrang und den daran befestigten Embryo behutsam von der Plazenta ab.Entfernen Sie überschüssiges Riesenzellgewebe an den Rändern der Plazenta. Um Zellklumpenbildung während der Herstellung einer Einzelzell-Suspension zu minimieren, sammeln Sie die Plazenta in einem geeigneten Behälter, beispielsweise einem 15-ml-Falcon-Röhrchen mit PBS und 5 % FCS, und stellen Sie es auf Eis. Führen Sie dies für alle sezierten Plazenten durch. An diesem Punkt können Sie entweder mit der Herstellung einer Einzelzell-Suspension für Durchflusszytometrie-Funktionsanalysen wie In-vitro-Kultur oder Transplantation fortfahren oder die gesamte Plazenta für die Gewebefixierung und Einbettung in feste, gefrorene Blöcke zur späteren Immunhistochemie vorbereiten.Wir zeigen Ihnen nun, wie man aus der Plazenta eine Einzelzell-Suspension für die Fax-Analyse herstellt. Bereiten Sie zunächst eine 0,1 %ige Kollagenase-Lösung in PBS mit 10 % FCS und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung vor. Geben Sie je nach Menge der Plazenta ein geeignetes Volumen der Kollagenase-Lösung hinzu; ein Volumen, das das Doppelte des Plazentavolumens beträgt, zwischen zwei und fünf Milliliter, wird empfohlen.Verwenden Sie eine 16-Gauge-Nadel, die an einer 5-ml-Spritze befestigt ist, um das Gewebe mechanisch zu disruptieren, indem Sie die Kollagenase-Lösung und Plazenta dreimal durch die Nadel spritzen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer 8-Gauge-Nadel. Stellen Sie die Probe nach der 45-minütigen Inkubation 45 Minuten lang in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO2.Bei der Kollagenase-Passage wird die Zelllösung durch eine 20-Gauge-Nadel gegeben und anschließend für weitere 45 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Nach der insgesamt eineinhalb Stunden dauernden Inkubation in der Kollagenase-Passage wird die Zelllösung dreimal nacheinander mit jeder Nadel (22 Gauge und 25 Gauge) durchgestossen. Danach wird die Probe durch einen 50-Mikrometer-Filter filtriert, der an einem neuen 15-ml-Falcon-Röhrchen befestigt ist, mit PBS plus 5 % FCS gewaschen und fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit 300 × g zentrifugiert. An diesem Punkt liegt eine Einzelzell-Suspension vor, die für die FACS-Analyse geeignet ist.Ich zeige Ihnen, wie man Plazentagewebe für die Immunhistochemie vorbereitet. Die Immunhistochemie von Plazentagewebe kann verwendet werden, um hämatopoetische Stammzellen im mikroenvironnementalen Bereich der Plazenta zu lokalisieren. Unmittelbar nach der Isolierung der Plazenta aus jedem Embryo werden diese in kaltem 1× PBS platziert; normalerweise eignet sich eine 96-Well-Platte am besten für junge Plazenten vom embryonalen Tag 8,5 bis 11,5, während für ältere Plazenten ab E 12,5 eine 24-Well-Platte möglicherweise praktischer ist.Jedes Plazenta wird in eine neue Vertiefung überführt, die mit frisch aufgetauter 4 % PARALDEHYD oder PFA gefüllt ist, und zwar für die Plazenta vom Tag E 12,5. Das Gewebe wird von Hand in eine neue Vertiefung verbracht. Bei der Plazenta vom Tag E 10,5 hingegen kann das PBS vorsichtig mit einer Pipette entfernt und anschließend das PFA hinzugefügt werden.Es ist wichtig, dass die Plazenta je nach Alter und Größe des Gewebes zwei bis vier Stunden bei vier Grad C vollständig eingetaucht wird. Danach überführen Sie das Gewebe in 30 % Saccharose. Falls die Gewebe sehr klein und zerbrechlich sind, aspirieren Sie das PFA und geben direkt die Saccharose hinzu.In diesem Stadium schwebt die Plazenta in der Lösung. Lassen Sie das Gewebe über Nacht bei vier Grad C. Nach dem Übernachtungsschritt in 30 % Sucrose sollten die Gewebe schließlich auf den Boden der Vertiefung absinken, was auf eine ordnungsgemäße Kryokonservierung hinweist. Entfernen Sie anschließend die Hälfte der Sucroselösung und ersetzen Sie das Volumen durch OCT.Stellen Sie das Gewebe für ein bis zwei Stunden bei vier Grad C zurück. Dies erleichtert das Eindringen von OCT. Schließlich wird das Gewebe für eine Stunde in hundertprozentiges OCT überführt, wonach es eingebettet werden kann.Plastikformen mit der entsprechenden Gewebeidentifikation beschriften. Das Gewebe aus der OCT-Lösung entnehmen und die Plazenta halbieren, indem die scheibenförmige Plazenta so ausgerichtet wird, dass die Seite mit der Nabelschnur nach unten zeigt, und vorsichtig mit der sauberen Rasierklinge durchtrennt wird, wobei sichergestellt werden muss, dass die Klinge rückwärts bewegt wird. Und viertens, bevor der Druck abgelassen wird, um einen gleichmäßigen Schnitt zu gewährleisten.Die Plazenta wird zur optimalen Orientierung für die spätere Visualisierung der plazentaren hämatopoetischen Stammzellen der Länge nach halbiert. Anschließend wird eine Plazentahälfte mit der Schnittfläche nach unten auf den Boden der Form gelegt, sodass sie die Bodenfläche der Form berührt. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer neuen Form für die andere Hälfte.Für Plazenten vom Embryonalstadium 10,5 (E 10,5) können beide Hälften mit derselben Technik in dieselbe Form gegeben werden. Beim Einfüllen des OCT in die Form kann es schwierig sein, die Plazenta in der richtigen Orientierung zu halten. Sichern Sie die Plazenta, indem Sie das Gewebestück mit einer Pinzette festhalten.Halten Sie eine Gewebeshälfte mit einer Pinzette und legen Sie die andere Gewebeshälfte an die Außenseite der Pinzette an. Gießen Sie dann langsam OCT-Lösung ein, wie für E 12,5 beschrieben. Sobald die Form mit OCT gefüllt ist, stellen Sie die Form schnell auf Trockeneis.Das OCT wird weiß, wodurch das Gewebe schockgefroren wird. Legen Sie die Form in einen kleinen Plastikbeutel und lagern Sie sie sofort in einem minus 80 °C-Gefrierschrank. Hier ist ein repräsentativer Schnitt einer E10,5-Plazenta. Wichtig ist, dass Ihre Schnitte die am unteren Bildrand sichtbare Chorionplatte sowie das plazentare Labyrinth enthalten, den Bereich der Plazenta, der den fetomaternalen Austausch ermöglicht und in der Bildmitte dargestellt ist.Dieser Abschnitt wurde mit einem CD31-Antikörper gefärbt, der das Endothel rot markiert hat. Die in braun dargestellten Trophoblasten werden durch Zytokeratin markiert. Das Labyrinth enthält sowohl fetale Gefäße, die rot gekennzeichnet sind, als auch mütterliche Bluträume, die von den braunen Trophoblasten ausgekleidet werden.Die blauen Zellen sind CD41-positive entstehende hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen, die Sie in der fetalen Gefäßbahn lokalisiert sehen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Einzelzell-Suspension aus der Masse der Plazenta präpariert und disseziert und wie man plazentare hämatopoetische Stammzellen mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Außerdem haben wir Ihnen gezeigt, wie man Schnitte von plazentarem Gewebe für die Visualisierung hämatopoetischer Stammzellen mittels Immunhistochemie vorbereitet.Es ist wichtig, bei der Durchführung dieser Verfahren auf einige kritische Parameter zu achten. Bei der Plazentadissektion ist es entscheidend, schnell zu arbeiten und die Embryonen sowie Lösungen so kühl wie möglich zu halten, um eine hohe Zellviabilität für die Herstellung einer Einzelzell-Suspension zu gewährleisten. Der Grad der mechanischen Dissoziation vorher sowie die Inkubationszeit während der enzymatischen Behandlung sind die wichtigsten Faktoren, die die Viabilität und Zellgesundheit beeinflussen.Und schließlich kann eine Überfixierung bei der Immunhistochemie Probleme für bestimmte Antigene verursachen, während eine Unterfixierung hingegen zur Zerstörung des Gewebes führen kann. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

isolation-and-analysis-of-hematopoietic-stem-cells-from-the-placenta

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt, wie Mikro-sezieren den Dottersack und Aorta-Gonaden-Mesonephros Region aus Embryonen und die Verwendung der Durchflusszytometrie, um hämatopoetische Stammzellen zu sortieren.

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Zwei Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen von 1) Hefe-Zellen und 2) menschlichen Plazenten werden vorgestellt. Das Herzstück der beiden Verfahren ist die Dichte-Zentrifugation, wobei die resultierende Schwimmschicht, die die Tröpfchen leicht mit dem Auge sichtbar gemacht werden, extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse für Reinheit quantifiziert.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und weiteren Untersuchung der infiltrierenden Leukozyten der Decidua basalis und der Decidua parietalis - der menschlichen mütterlich-fetalen Schnittstelle - beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, wie die Durchflusszytometrie-Analyse beweist.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und Analyse der infiltrierenden Leukozyten von Geweben an der mütterlich-fetalen Grenzfläche (Uterus, Dezidua und Plazenta) von Mäusen beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der meisten Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Durchflusszytometrie-Analysen.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Hier beschreiben wir Verfahren zur Präparation von fetalen und mütterlichen Geweben aus menschlichen Plazenta, gefolgt von der Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) aus diesen Geweben.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSCs (ST-HSCs) mit dem Hoxb5-Reportersystem vor.

Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen

Erfahren Sie die Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus der Mausplazenta für Entwicklungsbiologie. Diese Methode zeigt einzigartige Nischen zur Visualisierung und Analyse von HSCs während der Embryogenese.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Weitere Videos entdecken