Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

Die Gewebekultivierungstechnologie hat eine breite Anwendung auf dem Gebiet der Zellbiologie gefunden. Kultivierte Zellen müssen jedoch regelmäßig gewartet werden, um gesund zu bleiben. Wenn die Zellen die Kofluenz erreichen, müssen sie subkultiviert oder passageiert werden.

Geschieht dies nicht, führt dies zu einem verminderten Wachstum und schließlich zum Zelltod. In diesem Video zeigen wir, wie Gewebekulturzellen sowohl für adhärente als auch für Suspensionszelllinien erhalten werden können. Hallo, ich bin Ricky hier im Labor von Dr. LAN im Molecular Pathology Laboratories Network in East Tennessee.

Heute möchte ich euch zwei Techniken zum Verpacken, Suspension und Anhaften von Zellen zeigen. Um eine Platte mit Zellen zu passieren. Wir beginnen mit einer Primärkultur, die in einer 60-Millimeter-Petrischale oder einem 25 Zentimeter großen Gewebekulturkolben mit fünf mil Gewebekulturmedium auf Cofluency gezüchtet wird.

Wir beginnen damit, das gesamte Medium mit der sterilen Pipette aus der Primärkultur zu entfernen. Dann waschen wir die anhaftende Zellmonoschicht ein- bis zweimal mit einem kleinen Volumen von 37 Grad Celsius HBSS ohne Calcium und Magnesium. Um alle Reste von fötalem Rinderserum zu entfernen, die die Wirkung des Trypsin-Enzyms hemmen könnten, das im nächsten Schritt hinzugefügt wird.

Geben Sie als Nächstes so viel warme Trypsin-EDTA-Lösung in die Kultur, dass Sie die adhärente Zellschicht bedecken. Anschließend kannst du die Platte für ein bis zwei Minuten auf ein 37 Grad Celsius warmes Tablett legen. Klopfen Sie nach der Inkubation mit dem Boden der Platte auf eine ebene Fläche, um die Zellen zu lösen.

Überprüfen Sie die Kultur mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen abgerundet sind, was darauf hinweist, dass sie sich von der Oberfläche gelöst haben. Wenn die Zellen nicht ausreichend abgelöst sind, stellen Sie die Platte für ein oder zwei weitere Minuten in die Warmhalteschale. Nachdem Sie durch das Zielfernrohr geschaut haben, spülen Sie die Schale mit vollständigem Medium aus und pipettieren Sie die Suspension in ein konisches 15-mil-Röhrchen mit zwei mil vollständigem Medium.

Schleudern Sie die Zellen herunter, um sie zu pelletieren, und resuspendieren Sie das Pellet in vollem Medium. Geben Sie nun ein gleiches Volumen Zellsuspension zu jeder der frischen Platten, die entsprechend markiert wurden. Alternativ können die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt und auf die gewünschte Dichte verdünnt werden, so dass jeder Platte eine bestimmte Anzahl von Zellen hinzugefügt werden kann.

Achten Sie darauf, jeden Teller mit dem Datum der Subkultur und der Durchgangsnummer zu beschriften. Geben Sie nach Zugabe der Zellsuspension eine mil frisches Medium in jede neue Kultur. Inkubieren Sie nun die Platten in einem befeuchteten 37 Grad Celsius 5%CO2 Inkubator.

Nachdem Sie die Zellen über Nacht inkubiert haben, geben Sie frisches Medium in die Platten und stellen Sie sie wieder bei 37 Grad ein. Sobald die Platte konfluenzfähig geworden ist, können Sie die Platte erneut passieren, indem Sie diesen Vorgang wiederholen und bei Bedarf mit dem Durchgang fortfahren. Jetzt zeigen wir Ihnen, wie Sie Zellen in Suspensionskultur passagen.

Das Verpacken von Zellen in Suspensionskulturen ist einfacher als bei Adhärenzzellen. Vor dem Verpacken von Suspensionskulturen müssen die Zellen alle zwei bis drei Tage gefüttert werden, bis sie die Kofluenz erreichen, d. h. wenn die Zellen in der Suspension verklumpen und das Medium tur erscheint. Wenn der Kolben geschwenkt wird.

Nehmen Sie zu diesem Zweck den Kolben mit den Suspensionszellen aus dem Inkubator, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen, die sich auf dem Kolben abgesetzt haben, nicht gestört werden. Unter aseptischem Boden etwa ein Drittel des Mediums aus dem Kolben nehmen, entsorgen und durch das gleiche Volumen vorgewärmtes Medium bei 37 Grad Celsius ersetzen. Nachdem Sie das Medium gewechselt haben, schwenken Sie den Kolben und stellen Sie ihn wieder in den Inkubator, der bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2, ist.

Wenn weniger als 15 mil vorhanden sind, inkubiert ein Medium im Kolben den Kolben in horizontaler Position, um den Kontakt zwischen Zelle und Medium zu verbessern. Andernfalls kann der Kolben an den Tagen, an denen die Kulturen nicht gefüttert werden, vertikal inkubiert werden. Überprüfen Sie sie, indem Sie die Flats schwenken, um die Zellen wieder aufzuwirbeln.

Achten Sie darauf, dass sich die Farbe des Mediums verändert, was auf ein gutes Stoffwechselwachstum hinweist. Sobald die Kulturen zusammenfließen, was etwa 2,5 Millionen Zellen pro Monat sein sollte, können Sie sie passieren. Wieder einmal haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie kultivierte Zellen sowohl für adhärente als auch für Suspensionskulturen passagen können.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei all Ihren Experimenten.