Einfrieren, Auftauen und Packaging Cells für Verkehr

Zellkulturen werden in einer Vielzahl von Forschungs- und Diagnoseanwendungen eingesetzt. Es ist manchmal sinnvoll, Zelllinien für zukünftige Arbeiten einzufrieren, um die Zellen zu konservieren, das Altern der Zellen zu vermeiden, das Kontaminationsrisiko zu verringern und die Auswirkungen genetischer Drift zu minimieren. Zelllinien können zur Langzeitlagerung eingefroren werden.

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie man Zellen, die sowohl im Monolayer als auch in Suspension gezüchtet wurden, einfriert und anschließend wieder auftaut, um sie erneut kultivieren zu können. Hallo, ich bin Ricky aus dem Labor von Dr. LAN am Molecular Pathology Laboratories Network in Ost-Tennessee. Heute zeige ich Ihnen, wie man Zellen zur Langzeitlagerung einfriert und wie man sie aus flüssigem Stickstoff auftaut.

Um humane Adhärenzzellen einzufrieren, beginnen Sie damit, sie von der Platte abzulösen, wie Sie es auch bei der Aufbereitung für die Lagerung tun würden. Beachten Sie, dass es am besten ist, Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase für die Kryokonservierung zu verwenden. Sobald die Zellen sich gelöst haben und Sie die Trypsinreaktion durch Zugabe von Serum oder Medium mit Serum gestoppt haben, überführen Sie die Zellsuspension in ein steriles Zentrifugenröhrchen und fügen zwei Milliliter hinzu.

Komplettes Medium mit Serum: Zellen aus drei oder mehr Schalen aus derselben Unterart derselben Quelle können in einem Gefäß vereint werden. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 bis 350 ×g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL bei vier Grad Celsius.

Vervollständigtes Medium, eine gleiche Menge Vier-Grad-Gefrimedium hinzufügen, die Zellen gründlich mischen und dann das Röhrchen auf Eis stellen, um die Zellen zu zählen. Mit einem Hämozytometer die Suspension unter Zugabe weiteren Gefrimediums verdünnen, um eine endgültige Zellkonzentration von 1 Million oder 10 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Um Zellen aus einem nahezu konfluenten 25 cm²-Fläschchen einzufrieren, resuspendieren in etwa drei Milliliter Gefrimedium und pipettieren mit einer Pipette je ein Milliliter-Aliquot der Zellsuspension in beschriftete zwei-Milliliter-Kryoröhrchen.

Stellen Sie sicher, dass die Verschlüsse der Gefäße fest angezogen sind. Stellen Sie die Gefäße eine Stunde bis über Nacht in einen minus 80-Tiefkühler, anschließend überführen Sie sie in einen flüssigen Stickstoff-Lagerbehälter. Das Einfrieren von Zellen aus Suspensionkultur erfolgt prinzipiell ähnlich wie das Einfrieren von Zellen aus einer Monoschicht.

Der Hauptunterschied besteht darin, dass Suspensionkulturen nicht zuerst mit Trypsin behandelt werden müssen. Überführen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 300 bis 350 ×g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in vier Grad kaltem Kryomedium bei einer Dichte von einer Million bis zehn Millionen Zellen pro Milliliter.

Überführen Sie anschließend jeweils einen mL-Aliquot der Zellsuspension in Kryoröhrchen und frieren Sie ein. Wie bereits bei den Monolayer-Kulturen gezeigt, die im vorherigen Kapitel zum Auftauen und Wiederherstellen eingefrorener Röhrchen beschrieben wurden, entnehmen Sie zunächst das Röhrchen mit den Zellen dem flüssigen Stickstoffgefrierschrank und geben es unverzüglich in ein Wasserbad bei 37 Grad.

Schütteln Sie das Gefäß kontinuierlich, bis das Medium aufgetaut ist, was in der Regel weniger als 60 Sekunden dauert. Wischen Sie nach dem Auftauen die Oberseite des Gefäßes mit 70 % Ethanol ab, bevor Sie es öffnen. Überführen Sie dann die aufgetaute Zellsuspension in ein steriles Zentrifugenröhrchen, das zwei Milliliter warmes komplettes Medium und 20 % fetalen Kälberserum enthält, und zentrifugieren Sie.

Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 150 bis 200 ×g bei Raumtemperatur. In diesem Schritt wird jegliches verbleibendes DMSO entfernt. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Zellpellet vorsichtig in einer kleinen Menge – etwa einem Milliliter – komplettem Medium mit 20 % FBS resuspendiert. Überführen Sie dies in eine entsprechend beschriftete Kulturschale, die die geeignete Menge Medium enthält. Im Allgemeinen wird ein Milliliter Zellsuspension in fünf bis 20 Milliliter Medium benötigt.

Jetzt können Sie die Zellen nach 24 Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius stellen, um sie wachsen zu lassen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nach fünf bis sieben Tagen an der Platte angeheftet sind, oder wechseln Sie das Medium, sobald sich die Farbe des pH-Indikators im Medium verändert. Sie sollten die Kulturen so lange in einem Medium mit 20 % FBS halten, bis die Zelllinie wieder etabliert ist.

Wenn die Wachstumsrate äußerst gering ist, könnte nur eine Teilpopulation der ursprünglichen Kultur wachsen. Dies sollte besonders beachtet werden, wenn mit Zelllinien gearbeitet wird, die als mosaikartig bekannt sind. Wenn Kulturen versandt werden müssen, ist dies sowohl für Monolayer- als auch für Suspensionkulturen problemlos möglich.

In 25 cm² Zellkultur-Flaschen werden Zellen bis nahe zur Konfluenz als Monolayer oder bis zur gewünschten Dichte in Suspension kultiviert. Bei Monolayer-Kulturen wird zunächst das Medium entfernt und anschließend die Flasche mit frischem Medium aufgefüllt. Es ist entscheidend, dass die Flasche vollständig mit Medium gefüllt wird, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen, falls die Flaschen während des Transports umgedreht werden.

Für die Suspension wird frisches Medium hinzugefügt, um den Kolben zu füllen. Der Verschluss wird festgedreht und mit Parafilm gesichert. Der Kolben wird in einem auslaufsicheren Plastikbeutel oder einem anderen auslaufsicheren Behälter verschlossen, der darauf ausgelegt ist, Verschütten zu verhindern.

Falls das Kolben beschädigt wird, wird der Primärbehälter in einen sekundären isolierten Behälter gegeben, um ihn während des Transports vor extremen Temperaturen zu schützen. Ein Gefahrenhinweis für den Empfänger wird an der Außenseite der Verpackung angebracht. In der Regel werden Kulturen per Kurierdienst am selben Abend oder über Nacht versandt.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man humane Zellkulturen von sowohl anhaftenden als auch schwebenden Zellen einfriert und auftaut. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei all Ihren Experimenten.