Name: Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung myeloider dendritischer Zellen aus Mausknochenmarkvorstufen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellreifung und IL-12-Produktion für Immunologie und Impfstoffentwicklung.

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JB ist studentships aus dem Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) unterstützt. Unterstützung für dieses Projekt wurde von der Canadian Institutes of Health Research vorgelegt, Grant MOP-67066.

Dieses Protokoll wurde von Lutz et al angepasst worden. 1 Ernte und Verarbeitung von Knochenmark <ol><li> Die Isolierung der Tibia und Femur: Euthanize des Spenders Maus und besprühen Sie die Beine mit 70% Ethanol. Fassen Sie den ersten Knöchel fest mit einer stumpfen Zange und fangen an, schneiden Sie die Haut und die zugrunde liegenden Muskulatur der Tibia freizulegen. Um eine Beschädigung des Knochens, langsam und parallel geschnitten, um das Schienbein, so dass das Kniegelenk intakt. Zur Reinigung des Oberschenkelknochens, Immobilisierung des Kniegelenks durch Greifen mit einer stumpfen Zange. Entfernen Sie vorsichtig die Muskulatur mit einer scharfen Schere und einer gebogenen Pinzette. Weiter nach oben, bis das Hüftgelenk ausgesetzt ist und eine Schere zwischen dem Kopf des Oberschenkelknochens und des Hüftgelenks gelegt werden. Entfernen Sie die Knochen, indem zwischen Oberschenkel und Hüftgelenk und Ort in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf Eis. </li><li> Entfernung von Knochenmark: Sauberkeit übrigen Muskulatur von den Knochen mit einer Schere und einer gebogenen Pinzette. Schneiden Sie die Epiphysen der einzelnen Knochen und suchen Sie das Zentrum Hohlraum. Mit einem 10 mL Spritze mit PBS geladen und ein 25G0.5 &quot;Nadel, spülen Sie die Knochenmark in einem nicht-Gewebe beschichtete Petrischale. </li><li> Die Verarbeitung von Knochenmark: Verwenden Sie die Gummi-Ende des Kolbens aus einer 1 ml Spritze mit dem Knochenmark in eine Single-Zellsuspension distanzieren (verwenden Sie ein nach oben und unten, nicht kratzen Bewegung). Sammeln Knochenmark in eine konische Falcon-Röhrchen, und spülen verbleibende Knochenmark mit PBS. </li></ol> Kultur von dendritischen Zellen <ol><li> Die Zellen in DC Medien und zählen DC Vorläufern auf einer Zählkammer (Abbildung 1). Sie werden sehen, Zellen unterschiedlicher Größe, die Vorläufer der DC sind die größten und hellsten. Unterschiedlich zählen nur diese Zellen. Von zwei Oberschenkelknochen und zwei Unterschenkelknochen eines Wildtyp C57BL / 6 Mäuse (6-8 Wochen alt), sollten Sie zwischen 25-40 x 10 6 insgesamt DC-Vorstufen zu erwarten. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> Abbildung 1 </li><li> Kultur-Zellen bei einer Dichte von 2 x 10 5 DC Vorläufern / mL in DC-Medien mit 40 ng / mL rekombinantem murinen GM-CSF ergänzt. Platte Zellen in nicht-Gewebe beschichtete Polystyrol Petrischalen. </li></ol> Add media (Tag 3) Zur Aktualisierung der Medien, die Hälfte des Gesamtvolumens von frischen Medien mit 40 ng / mL GM-CSF ergänzt. Ersetzen Sie ein Drittel der Medien (Tag 6) und Reifung Zur Aktualisierung der Medien, vorsichtig ein Drittel des Gesamtvolumens von Medien und ersetzen dieses Volumen mit frischem DC-Medien mit 40 ng / mL GM-CSF am Tag 6 der Kultur ergänzt. Falls gewünscht, können dendritische Zellen zur Reifung mit Zytokinen oder Toll-like-Rezeptor-Liganden stimuliert werden. In dem Video wurden DCs durch Übernacht-Stimulation mit 5 ng / mL CpG gereift. Ernte von dendritischen Zellen DC Kultur abgeschlossen ist (Abbildung 2). Zellen sowohl in Suspension und locker auf die Platte geklebt werden. Anhaftenden Zellen kann durch Abkratzen der Schale mit einer Gewebekultur Schaber und Spülen mit PBS entfernt werden. Die Gesamtzahl der Zellen 5-8 fache während der einwöchigen Kultur und Differenzierung Zeitraum zu erhöhen, daher erwarten, 1-1,6 x 10 6 Zellen / ml zu ernten. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Abbildung 2" width="407" height="358" /> Abbildung 2 Reagenzien <ol><li> DC Medien <ol><li> RPMI-1640 Medium, ergänzt mit: </li><li> 10% Fötales Rinderserum </li><li> 100 IU / ml Penicillin </li><li> 100 ug / ml Streptomycin </li><li> 1% L-Glutamin </li><li> 0,1% 2-Mercaptoethanol </li><li> 1X nicht-essentiellen Aminosäuren </li><li> 1X Natriumpyruvat </li></ol></li><li> Rekombinantes murines GM-CSF <ol><li> rmGM-CSF (PeproTech inc, New Jersey, Katalog-Nr. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

DCs sind für das Studium der angeborenen und adaptiven Immunsystems Interaktionen nützlich, und kann als Impfstoffvektor eingesetzt werden. In diesem Video haben wir die Schritte, um Knochenmark zu isolieren und zu differenzieren myeloide dendritische Zellen in vitro nachgewiesen. Nach der Kulturzeit, können diese Zellen mikroskopisch visualisiert werden sowohl als adhärente Zellen, die oft über Dendriten, und nicht haftende Rundzellen. Die DCs können weitere für die Antigen-Präsentation werden von Pulsen mit Antigen manipuliert oder stimul...

<table><tbody><tr><td>rekombinanter muriner GM-CSF</td><td>Reagenz</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

kultur myeloide dendritische zellen aus dem knochenmark vorstufen

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloide dendritische Zellen (DCs) werden häufig verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen angeborenen und erworbenen Immunmechanismen und die frühe Reaktion auf eine Infektion zu studieren. Da diese die stärksten Antigen-präsentierende Zellen sind, sind DCs zunehmend als Impfstoff Vektor verwendet, um die Induktion von Antigen-spezifische Immunantwort zu untersuchen. In diesem Video zeigen wir, das Verfahren für die Ernte tibias und Oberschenkelknochen von einem Spender-Maus,-verarbeitung im Knochenmark und Differenzierung DCs in vitro. Die Eigenschaften der DCs ändern nach Stimulation: unreife dendritische Zellen sind potente Phagozyten, während reife DCs in der Lage Antigen-Präsentation und Interaktion mit CD4 + und CD8 + T-Zellen sind. Diese Veränderung in der funktionellen Aktivität entspricht der Hochregulation von Zelloberflächenmarker und Zytokin-Produktion. Viele Mittel können zu reifen DCs, darunter Zytokine und Toll-like-Rezeptor-Liganden verwendet werden. In diesem Video zeigen wir durchflusszytometrische Vergleiche der Expression von zwei Co-stimulatorischen Molekülen, CD86 und CD40, und das Zytokin IL-12 nach Stimulation mit CpG über Nacht oder mock-Behandlung. Nach Differenzierung kann DCs weiter für die Verwendung als Impfstoff-Vektor manipuliert oder Antigen-spezifische Immunantwort durch in vitro zu erzeugen pulsierende Verwendung von Peptiden oder Proteinen, oder transduziert mit rekombinanten viralen Vektoren.

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Myeloische dendritische Zellen (DCs) werden häufig eingesetzt, um die Wechselwirkungen zwischen angeborenen und adaptiven Immunmechanismen sowie die frühe Antwort auf ... zu untersuchen.

Mein Name ist Jeanette Boudreaux, und heute möchte ich Ihnen die Schritte zur Kultivierung spiegelnder myeloischer dendritischer Zellen aus Knochenmarkvorläufern erläutern. Die myeloische DC-Linie gewinnt zunehmend an Bedeutung für Untersuchungen zum Zusammenspiel von angeborener und adaptiver Immunität und wird darüber hinaus verstärkt als Plattform für die Impfstoffentwicklung genutzt. Heute führen wir Sie durch die Schritte zur Isolierung der Vorläuferzellen, deren Einbringen in Kultur und deren Differenzierung zu dendritischen Zellen.Anschließend zeige ich Ihnen eine Durchflusszytometrie-Analyse der Zellen vor und nach der Reifung. Unter Einwirkung des Toll-ähnlichen Rezeptor-Liganden proliferieren die Zellen in vitro während der Kultivierungszeit, sodass im Vergleich zu den Vorläuferzellen, die Sie am Tag null ausgesät haben, ein Anstieg der Gesamtzellzahl um das Fünf- bis Achtfache zu erwarten ist. Die heute von mir vorgestellten Verfahren werden auf einer offenen Laborbank demonstriert, zur Wahrung der Sterilität empfehle ich jedoch, Ihre Kulturen in einem biologischen Sicherheitswerkbank oder einem laminaren Flussgehäuse durchzuführen.Als Erstes benötigen Sie eine 10-mil-Sp

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Antigen-Präsentation in sekundären lymphatischen Organen durch dendritische Zellen ist entscheidend für die Einleitung des T-Zell-vermittelten adaptive Immunantwort. Hier zeigen wir die Kultur von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, Aktivierung und Etikettierung für die 2-Photonen-Imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von dendritischen Zellen - Schlüsselantigen-präsentierende Zellen, die T-Zellen aktivieren - aus dem Knochenmark einer erwachsenen Maus.

Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zur Erzeugung plasmazytoider dendritischer Zellen (pDCs) aus gängigen lymphoiden Vorläuferzellen (CLPs). Bei der Co-Kultivierung von gereinigten CLPs mit γ-bestrahlten Feeder-Zellen in Gegenwart von Fms-ähnlichen Tyrosinkinase-3-Liganden (FL) differenzieren sich die CLPs in nicht-adhärente pDCs, deren Vorhandensein mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird.

In vitro Erzeugung von plasmozytoiden dendritischen Zellen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen

Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Knochenmarkzellen, die mit dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kultiviert wurden, erzeugen eine heterogene Kultur, die Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) enthält. Diese Methode konzentriert sich auf die Verwendung von MHCII- und Hyaluronan (HA)-Bindung zur Unterscheidung von Makrophagen von den DCs in der GM-CSF-Kultur. Makrophagen in dieser Kultur haben viele Ähnlichkeiten mit Alveolarmakrophagen.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Hier zeigen wir, wie Monozyten durch magnetische Kügelchentrennung aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes nach Dichtegradientenzentrifugation von humanem antikoaguliertem Blut isoliert werden. Nach einer 5-tägigen Inkubation werden die menschlichen Monozyten in unreife dendritische Zellen differenziert und sind bereit für experimentelle Verfahren in einer nicht-klinischen Umgebung.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Lernen Sie die Kultivierung myeloider dendritischer Zellen aus Mausknochenmarkvorstufen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellreifung und IL-12-Produktion für Immunologie und Impfstoffentwicklung.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

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