Name: Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Netzhautscheiben des Tigersalamanders für Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Untersuchungen visueller Reizantworten in der Netzhaut.

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Lösungen <ul><li> Intrazelluläre Lösung für Ganglienzellen (in mm): 100 K-Gluconat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, .5 GTP, 90 uM Sulforhodamine B (für die Färbung), auf pH = 7,4 mit angepassten KOH </li><li> Intrazelluläre Lösung für bipolare Zellen (in mm): 90 K-Gluconat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, .5 GTP, 90 uM Sulforhodamine B (für die Färbung), auf pH = 7,4 mit angepassten KOH </li><li> Extrazelluläre Ringer-Lösung (in mM): 112 NaCl, 5 Glucose, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, eingestellt auf pH = 7,75 mit NaOH. Oxygenierung der Lösung ist nicht notwendig. </li></ul> Bereiten Sie die Aufnahme Kammern Unsere Aufnahme Kammer besteht aus einem Mikroskop-Objektträger mit einem Klebstoff auch in die kleinen Silikon-Blöcke aus einem anderen Klebstoff schneiden gut aufgestellt, um Stabilität für die Gewebeschnitte Verfügung zu stellen. Vorbereitung der Netzhaut Scheiben Um zu vermeiden, Bleichen der Photorezeptoren ist die Zerlegung in IR-oder dim rotes Licht Licht durchgeführt. Wenn man interessiert sich für die Aufnahme Antworten von der Stange Weg, sollte nur IR-Licht verwendet (IR Präpariermikroskop und kein Licht ausgesetzt wird. Zusätzlicher IR-Brillen für Verfahren unter dem Mikroskop nicht getan werden sollte verwendet werden). Wenn man vor allem in der Aufnahme Kegel Licht Reaktionen, dim red room Licht oder eine rote Blitzlicht interessiert ist, kann verwendet werden. Das Mikroskop sollte jedoch noch IR Okulare. Wenn Photorezeptor-Eingang ist irrelevant für das Experiment, können Verfahren, die in normalen Raumbeleuchtung durchgeführt werden mit einem normalen Mikroskop. <ol><li> Bereiten Sie zwei Objektträger mit einem Kleber Silikon gut: Erstellen Sie zwei parallele Bänder von Silikonfett (etwa .5 cm Abstand) auf jeder Folie und platzieren Sie ein rechteckiges Stück Filterpapier auf einer Seite der Folie, wo sowohl Fett-Bands (drücken Sie den Filter Papier mit einem Teil einer Rasierklinge so dass es gut ist, um die Folie im Anhang) </li><li> Sacrifice ein Salamander nach festgelegten Protokollen: Das Tier ist in einem Eisbad für 30 Minuten gelegt, dann enthauptet und doppelklicken pithed. </li><li> Entfernen Auge von Salamander Kopf und legen Sie sie unter dem Binokular auf ein Stück Seidenpapier angefeuchtet mit eiskaltem Ringer-Lösung </li><li> Entfernen Sie das Bindegewebe aus dem Auge </li><li> Verwenden Sie Rasierklinge einen kleinen Schnitt in der Hornhaut machen </li><li> Halten Sie schneiden Hornhaut mit einer Pinzette entfernen, während sie mit einer Schere entlang der Bindung an das Auge </li><li> Nehmen Sie das Objektiv mit einer Pinzette </li><li> Halten Sie die Blende mit einer Pinzette und schneiden entlang der ora serrata, um die Iris zu entfernen </li><li> Schneiden Sie die Augenmuschel in zwei rechteckige Stücke </li><li> Pick-up eines der Stücke und legen Sie sie Sklera nach oben auf das Filterpapier (stellen Sie sicher, abzuflachen das Stück während Sie es sich sehr genau) </li><li> Heben Sie die Lederhaut vor der Netzhaut, die nun sollte dem Filterpapier befestigt werden </li><li> Schnelles Hinzufügen von eiskalter Ringer-Lösung, die auch </li><li> Wiederholen Sie das gleiche für das zweite Stück </li><li> Verwenden einer Rasierklinge in einem speziell angefertigten Allesschneider bis 200-300 pm breite Scheiben schneiden platziert. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette zur Aufnahme der Scheiben an der Seite des Filterpapiers, schalten Sie sie so, dass die Schichten der Netzhaut sichtbar, und sie auf die Vakuum-Fett-Bands </li><li> Wählen Sie ein Slice, das unbeschädigt aussieht und zeigt horizontale Streifen zeigt die Schichten der Netzhaut (die Schichten sind manchmal schwer zu unter Dissektionsmikroskop zu sehen, wie die Vergrößerung ist nicht hoch genug, aber wenn man einige Schichtung erkennen kann, die Scheibe ist in der Regel gut genug. Die endgültige Entscheidung darüber, ob die Scheibe zu verwenden, jedoch wird, wenn es unter dem aufrechten Mikroskop betrachtet wird). Move it, um die Aufnahme Kammer gleiten durch den Bau einer Ringer Brücke zwischen den beiden Folien </li><li> Stellen Sie sicher, das Filterpapier gegen die Gummi-Blöcke in der Aufnahme Kammer geschoben, so dass die Scheibe nicht gekippt (Ganglienzellen und Photorezeptoren sollte im Fokus zugleich sein) </li></ol> Platzierung des Gewebes in der Aufnahme rig <ol><li> Die Aufnahme Folie unter das Mikroskop gelegt und perfundierten mit Ringer-Lösungen durch eine Schwerkraft Perfusion syste </li><li> Die Zubereitung ist sichtbar mit einem aufrechten Mikroskop mit 10x und 40x Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Auch hier verwenden wir nur IR-Licht, um zu verhindern das Ausbleichen der Photorezeptoren. Ein IR-Kamera ist an den seitlichen Anschluss des Mikroskops, die zu einem TV-Bildschirm angeschlossen ist angebracht. </li></ol> Visuelle Stimulation Visuelle Reize werden in Matlab mit dem Psychtoolbox programmiert und sind auf die Netzhaut durch den oberen Anschluss des Mikroskops mit Hilfe eines Mikroskopie Bild Injektor (MBF bioscience) projiziert. A Bits + + Digital Video Processor (Cambridge Research Systems) verwendet, um eine 14bit Leuchtdichte Maßstab zu erhalten und Synchronisationsspgonize Stimulus Präsentation mit Datenerfassung. Die visuelle Reize in diesem Video verwendet werden helle oder dunkle Balken (width = 460μm) von 100% Kontrast, der für zwei Sekunden auf einem stabilen einheitlichen Hintergrund (vorgestellt Luminanz = 8 * 10 4 Photonen / um / s, Größe: 1,84 x 1.38mm). Elektrophysiologie <ul><li> Mit einer Mikropipette puller: Patch-Elektroden sind aus Borosilikatglas (.. 1,5 mm, ID 84mm OD) gezogen. Für Ganglienzellen sind Widerstände zwischen 2 und 4 MOhm. Für bipolare Zellen, sind höhere Widerstände zwischen 4 und 8 MOhm verwendet. </li><li> Voltage Clamp-Aufnahmen sind mit Hilfe einer Multiclamp 700A (Molecular Devices), Verstärker-und Labor-interne Software in LabVIEW programmiert. </li><li> Drogen sind durch einen 8-Kanal-Perfusion System perfundiert. Die Mikroperfusion Elektrode liegt in der Nähe der Scheibe (das Gewebe sollte sichtbar bewegt, wenn Sie die Durchblutung ein-und ausschalten, aber man muss vorsichtig sein, dass der Druck nicht zu stark, so dass die Scheibe könnte sich lösen von dem Filterpapier) gestellt. Bei Versuchen der Mikroperfusion sollte ständig eingeschaltet sein (Perfusion Control-Lösung, wenn keine Medikamente benötigt werden), so dass die Aufzeichnung nicht durch Einschalten der Perfusion und Ausschalten gestört. </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

Vorteile: <ol><li> Alle Zelltypen sind zugänglich </li><li> Leichte Identifikation von Zelltypen, insbesondere wenn ein Fluoreszenzfarbstoff an die Elektrode zugesetzt </li><li> Pharmakologische Wirkstoffe leicht zu erreichen Zielzellen </li><li> Die Patch-Clamp-Technik erlaubt es, die Rolle der verschiedenen Ionenkanäle in der Netzhaut Berechnungen zu untersuchen. Die gleichen Informationen können nicht durch extrazellulären spike-Aufnahmen oder Aufnahmen mit scharfen Elektroden erzielt werden. </li><li> Diese T...

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>Spannungs-Klemm-Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Präparationsmikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Ausgestattet mit 40x- und 10x-Wasserimmersionsobjektiven, Fluoreszenzfiltern und Quecksilberlampe</td></tr><tr><td>P-97</td><td>Mikropipetten-Ziehgerät</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>Mikroskop-Bildinjektor</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Kanal-Perfusionssystem</td><td>Mikroperfusion</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Digitaler Videoprozessor</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarot-Augenstücke</td><td>Sonstiges</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klebende Silikonkammern</td><td>Sonstiges</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>20 mm Durchmesser, 1,0 mm Tiefe</td></tr><tr><td>Membranfilter</td><td>Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Borsilikat-Glaskapillaren</td><td>Elektroden-Glas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Filter</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>4 mm Filter, .2 µm Nylonmembran, Polypropylengehäuse</td></tr><tr><td>IR-Kamera</td><td>Am Mikroskop montierte Kamera</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, B7W-Videokamera</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Strychnin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol-4-essigsäure-Natriumsalz</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Larven von Tigersalamandern</td><td>Tier</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ganzzellableitungen of light evozierten exzitatorischen synaptischen ströme in der netzhaut scheiben

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Wir nutzen die whole-cell Patch-Clamp-Technik, um die synaptische Schaltungen, die zugrunde liegende visuelle Informationsverarbeitung in der Netzhaut zu untersuchen. In diesem Video werden wir Sie durch den Prozess der Durchführung Ganzzellableitungen des Lichts hervorgerufen Ströme der einzelnen Zellen in der Netzhaut schneiden Vorbereitung leiten. Wir nutzen die aquatische Tiger Salamander als Tiermodell. Wir von der Beschreibung der Dissektion des Auges beginnen und zeigen, wie Scheiben für elektrophysiologische Aufzeichnungen sind montiert. Sobald die Scheibe in der Aufnahme Kammer gegeben ist, zeigen wir, wie man whole-cell voltage clamp Aufnahmen durchzuführen. Wir projizieren visuelle Reize auf die Photorezeptoren in der Scheibe, um Licht hervorgerufene aktuelle Antworten zu entlocken. Während der Aufnahmen haben wir versorgen die Scheibe mit pharmakologischen Mitteln, wobei eine 8-Kanal-Perfusion-System ermöglicht es uns, schnell zwischen verschiedenen Agenten zu wechseln. Die Netzhaut Scheibe Vorbereitung ist weithin bekannt für Patch Clamp Messungen in der Netzhaut, insbesondere auf amakrinen oder bipolare Zellen, die nicht zugänglich sind in einer ganzen-mount Vorbereitung zu studieren.

Dieses Video zeigt den Prozess der whole-cell voltage clamp Aufnahmen in der Netzhaut Scheibe der aquatischen Tiger Salamander. Wir zeigen die Herstellung der Scheibe als auch, wie man Patch Clamp Messungen während visueller Stimulation der Netzhaut führen.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

Wir verwenden die Whole-Cell-Patch-Clamp-Technik, um die synaptischen Schaltkreise zu untersuchen, die der Verarbeitung visueller Informationen in der Retina zugrunde liegen. In diesem Video ...

Heute zeige ich Ihnen, wie man Netzhautschnitte des Tigersalamanders für Patch-Clamp-Aufzeichnungen vorbereitet. Zunächst bereite ich zwei Arten von Objektträgern vor. Wir verwenden Objektträger, an die eine klebende Vertiefung angebracht ist, sodass wir sie als Flüssigkeitskammern nutzen können.Auf den ersten Objektträger bringe ich zwei parallele Streifen Vakuumfett auf. Dann nehme ich ein Filterpapier und schneide es mit einer Rasierklinge in rechteckige Stücke. Nun lege ich eines der Stücke auf die Fettstreifen und drücke es fest, sodass es gut am Objektträger haftet.Ich mache dasselbe mit dem anderen Stück. Die zweite Art von Objektträger hat kleine Gummiblöcke, die darauf geklebt sind. Vorläufig füge ich nur etwas Vakuumfett zwischen die Blöcke hinzu und lege außerdem ein neues Stück Rasierklinge in den Gewebeschneider ein.Abschließend lege ich die Werkzeuge bereit, die ich während der Dissektion benötigen werde: zwei Paar Pinzetten, eine Schere und ein Werkzeug, um das Auge aus dem Kopf zu entfernen, um lichtinduzierte Ströme aufzuzeichnen. Die Dissektion sollte unter Infrarotlicht durchgeführt werden, jedoch werde ich der Demonstration halber nun im Licht arbeiten. Zuerst e

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Das Video beschreibt die elektrophysiologische Aufzeichnung von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen. Die Schnitte, die den dorsalen lateralen Nucleus geniculatus (dLGN) enthalten, werden in eine Aufnahmekammer gelegt. Eine stimulierende Pipette wird entweder auf dem Sehtrakt positioniert, um retinale Ganglienzellen (RGCs) zu stimulieren und retinogenikulate Synapsen zu untersuchen, oder auf dem Nucleus reticularis thalami, um kortikale Neuronen zu...

Eine elektrophysiologische Studie von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von lichtevozierten postsynaptischen Reaktionen in einer dunkeladaptierten Maus-Netzhaut-Gewebeschnittpräparation. Der Netzhautschnitt wird in eine Aufnahmekammer gelegt, und eine Aufnahmepipette wird verwendet, um die elektrische Kontinuität mit einer retinalen Ganglienzelle herzustellen. Mit Lichtimpulsen werden exzitatorische postsynaptische Potentiale in den Ganglienzellen erzeugt, die mit der Pipette aufgezeichnet werden.

Lichtevozierte postsynaptische Reaktionen in Neuronen von Netzhautschnitten von Mäusen

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Untersuchung der synaptischen Effizienz im lateralen entorhinalen Kortex (LEC) durch optogenetische Stimulation der medialen präfrontalen Kortex (mPFC) Axone und Aufzeichnung der Reaktionen von Pyramidenneuronen im LEC. Diese Methode kombiniert Patch-Clamp-Aufzeichnungen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation, um die synaptische Plastizität zu untersuchen.

Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

Wir beschreiben die Herstellung von dünnen Scheiben von retinalen Wasserorganismen Tiger Salamander...

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

Wir werden zeigen, wie man Netzhautschnitte aus dem Mausauge präpariert und Lichtreaktionen in retinalen Neuronen aufzeichnet. Das gesamte Verfahren wird unter dunkeladaptierten Bedingungen durchgeführt.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.

Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.

Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

In dieser Arbeit wird ein alternatives Flatmount-Retina-Präparat vorgestellt, bei dem die Entfernung von Photorezeptor-Zellkörpern eine schnellere Antikörperdiffusion und einen verbesserten Patch-Pipettenzugang zu inneren Netzhautneuronen für Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Split Retina als verbessertes Flatmount-Präparat zur Untersuchung von Neuronen der inneren Kernschicht in der Netzhaut von Wirbeltieren

Lernen Sie die Präparation von Netzhautscheiben des Tigersalamanders für Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Untersuchungen visueller Reizantworten in der Netzhaut.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

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