Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

Heute zeige ich Ihnen, wie man Netzhautschnitte des Tigersalamanders für Patch-Clamp-Aufnahmen vorbereitet. Zunächst bereite ich zwei Arten von Objektträgern vor. Wir verwenden Objektträger, an die eine klebende Vertiefung angebracht ist, sodass wir sie als Flüssigkeitskammern nutzen können.

Auf den ersten Objektträger bringe ich zwei parallele Streifen Vakuumfett auf. Dann nehme ich ein Filterpapier und schneide es in rechteckige Stücke mit einem Lichtstrahl zurecht. Nun lege ich eines der Stücke auf die Fettstreifen und drücke es fest, sodass es gut am Objektträger haftet.

Ich mache dasselbe mit dem anderen Stück. Die zweite Art von Objektträger hat kleine Gummiblöcke, die darauf geklebt sind. Vorläufig füge ich nur etwas Vakuumfett zwischen die Blöcke hinzu und lege außerdem ein neues Stück Rasierklinge in den Gewebeschneider.

Abschließend lege ich die Werkzeuge bereit, die ich während der Dissektion benötigen werde: zwei Paar Pinzetten, eine Schere und ein Werkzeug, um das Auge aus dem Kopf zu entfernen, um lichtinduzierte Ströme aufzuzeichnen. Die Dissektion sollte unter Infrarotlicht durchgeführt werden, allerdings werde ich der Demonstration halber nun im Licht arbeiten. Zunächst entferne ich das Auge und platziere es unter dem Mikroskop auf einem Stück Filterpapier, das ich mit eiskalter Ringer-Lösung angefeuchtet habe.

Danach entferne ich zusätzliches Bindegewebe vom Augapfel, um sicherzustellen, dass es das Auge nicht beschädigt. Ich schneide dabei immer entlang der Oberfläche. Das ist es, was Sie durch das Mikroskop sehen.

Danach verwende ich eine Rasierklinge, um einen kleinen Schnitt in die Hornhaut zu machen. Dazu halte ich das Auge mit der Pinzette fest, während ich die Kante der Rasierklinge auf die Hornhaut drücke. Anschließend halte ich die Hornhaut mit der Pinzette fest und entferne sie mit der Schere, um die Linse herauszunehmen.

Ich übe etwas Druck auf die Ränder der Augenschale aus, um mit der Pinzette leicht auf die Linse zuzugreifen. Anschließend entferne ich die Regenbogenhaut. Ich halte die Iris mit der Pinzette fest, während ich entlang der Aura serata schneide, bis nur noch die Augenschale übrig bleibt.

Dann schneide ich die I-Tasse in zwei rechteckige Stücke. Zuerst halbiere ich sie und schneide anschließend die oberen und unteren Kanten zurecht. Nun nehme ich einen der zuvor vorbereiteten Objektträger, hebe ein Stück der I-Tasse auf und lege es mit der Netzhautseite nach unten auf das Filterpapier.

Danach hebe ich diese Bindehaut an, sodass nur noch die Netzhaut auf dem Objektträger verbleibt. Anschließend gebe ich schnell unsere Lösung in die Kammer. Wiederholen wir den Vorgang für das zweite Netzhautstück.

Dieses Mal können Sie jedoch durch das Mikroskop beobachten, während Sie die Netzhaut auf das Filterpapier legen. Mit der Pinzette in meiner linken Hand drücke ich vorsichtig auf die Sklera. Schließlich schneide ich die Netzhaut in Schnitte mit einer Breite von 200 bis 300 Mikrometer.

Danach wähle ich eine Schnittpräparation für meine Experimente aus. Um eine geeignete Schnittpräparation auszuwählen, muss ich die Schnitte um 90 Grad drehen, damit ich die Schichten der Retina erkennen kann. Ich wähle eine Schnittpräparation aus, die unbeschädigt erscheint und deutliche horizontale Bänder aufweist, die auf die verschiedenen Schichten hinweisen.

Um die Objektträger von einem auf einen anderen zu übertragen, erstelle ich eine Ringers-Brücke und bewege die Objektträger dann vorsichtig durch die Lösung. Wenn ich das Präparat ablege, drücke ich es gegen die Gummiblöcke, sodass das Filterpapier senkrecht zum Glas ausgerichtet ist. Nun bin ich bereit für die Patch-Clamp-Aufzeichnung.

Wir lagern die intrazelluläre Lösung portionsweise im Gefrierschrank, sodass wir nur die Menge auftauen, die wir an einem Tag tatsächlich benötigen. Vor dem Befüllen der Elektroden filtrieren wir die Lösung, um kleine Partikel zu entfernen, die die Elektrodenspitze verstopfen könnten. Die Patch-Elektroden werden aus Borosilikat-Kapillarglas gezogen, um von Ganglienzellen abzuleiten.

Ich wähle eine Zugkraft-Einstellung, die Elektrodenwiderstände zwischen zwei und vier Megaohm erzeugt. Beim Befüllen der Elektroden möchte ich sicherstellen, dass sich keine Luftblasen an der Elektrodenspitze befinden. Durch leichtes Anklopfen des Glases mit dem Finger können Blasen entfernt werden.

Dies ist der Elektrodenhalter, der am Kopfstadium befestigt ist. Die Elektro-Rolle enthält einen Silberchlorid-Draht. Dies ist die Erdungselektrode mit einer Niga-Brücke.

Hier ist die Perfusionspipette. Sie ist an ein achtkanaliges Mikroperfusionssystem angeschlossen. Die Hauptperfusion erfolgt gravitativ, das heißt, es handelt sich lediglich um eine Flasche, die mit Wingers gefüllt ist, und die Lösung fließt durch diesen Schlauch in die Aufnahmekammer.

Um im Dunkeln aufnehmen zu können, habe ich eine IR-Kamera an den Seitenanschluss des Mikroskops angeschlossen, die mit einem Fernsehbildschirm verbunden ist. Am oberen Anschluss habe ich einen Bildprojektor angeschlossen, mit dem es möglich ist, visuelle Reize auf die Netzhaut zu projizieren. Und schließlich der Patch-Clamp-Verstärker.

Ich platziere nun den Netzhautschnitt unter dem Mikroskop und füge die Bodenelektrode in das Bad ein, um die Hauptperfusion einzurichten. Als Nächstes füge ich den Schlauch des Gravitations-Perfusionssystems hinzu. Das Glasrohr auf der anderen Seite ist mit einer Vakuumsaugung verbunden, wodurch der Flüssigkeitsspiegel konstant gehalten wird.

Ich stelle außerdem sicher, dass ein Absaugrohr mit der Elektroschulter verbunden ist. Anschließend positioniere ich die Mikroperfusionspipette und senke sie unter Beobachtung durch das Mikroskopobjektiv in das Bad ab.

Sobald ich der Schnitte nahe komme, ziehe ich sie leicht zurück, damit die Lösung den Schnitt trifft. Wenn ich die Perfusion einschalte, sollte ich sehen, dass sich der Schnitt leicht bewegt, wie hier. Suchen wir nun nach einer geeigneten Zelle, von der aus aufgezeichnet werden kann.

Wir suchen Ganglienzellen, die sich am unteren Rand des Schnitts befinden. Bevor ich die Elektrode in das Bad einführe, bereite ich sie vor und lege einen positiven Druck an. Sobald ich die Elektrode unter dem Mikroskop lokalisiert habe, senke ich sie direkt über dem Schnitt ab, um eine Zelle anzupatchen.

Ich wechsle zum 40x-Objektiv. Nun nullstelle ich den Basisstrom und überprüfe den Elektrodenwiderstand. Der Dichtetest besteht aus einer Abfolge von 10-Millivolt-Impulsen, die mir helfen zu erkennen, ob ich eine enge Dichtung zwischen der Elektrode und der Zelle hergestellt habe.

Ich senke nun meine Elektrode auf die Zielzelle ab. Sobald ich eine Delle am Zellkörper sehe, löse ich den positiven Druck aus dem Schlauch, wodurch sich ein dichter Verschluss bildet. Der Widerstand ist nun so hoch, dass die Stromspur flach erscheint.

Die kleinen Spitzen sind Kapazitätsartefakte der Elektrode. Diese können auf diese Weise kompensiert werden, sodass sie nun verschwunden sind. Nun werde ich versuchen, in die Zelle einzudringen.

Dazu gebe ich vorsichtig kleine Saugimpulse auf das Rohr, das mit der Elektrodenschulter verbunden ist, und wenn alles richtig funktioniert, sehen Sie, wie sich die Stromspur wie folgt verändert. Die jetzt sichtbaren Spikes werden von der Membrankapazität überquert und können nun auch dafür kompensiert werden. Dies ist eine Vorbereitung, die im Dunkeln durchgeführt wurde. Mal sehen, ob wir lichtinduzierte Antworten aufzeichnen können.

Die Spur, die Sie auf dem Oszilloskop sehen, ist die Stromantwort einer Ganglienzelle, die bei minus 60 Millivolt spannungsgeklemmt wurde. Die Lichtreize, die wir verwenden, sind helle und dunkle Balken, die auf einem gleichmäßigen, konstanten Hintergrund präsentiert werden. Die Software unseres Labors zeigt die vollständige Aufzeichnung eines Versuchs.

Man erkennt, dass es sich um eine Off-Zelle handelt, da sie auf das Einsetzen eines dunklen Balkens und das Verschwinden eines hellen Balkens reagiert. Die weiße Linie oben zeigt die Dauer des Stimulus an. Nun können wir Experimente durchführen, bei denen wir verschiedene pharmakologische Substanzen zuführen.

Zum Beispiel können wir die synergistische Hemmung durch GABAerge und Glycinerge Neuronen blockieren. Nachdem wir weniger als eine Minute gewartet haben, können wir normalerweise bereits die Wirkung des Wirkstoffs hier beobachten. Die Antwort wurde stärker und länger anhaltend.

Die Herstellung von Netzhautschnitten wird häufig verwendet, um synaptische Ströme aus verschiedenen Zellen der Netzhaut aufzuzeichnen, und durch Zugabe eines fluoreszierenden Farbstoffs zur Elektrolytlösung kann der Zelltyp leicht bestätigt werden. Anatomisch verwenden wir hier den larvalen TGA-Salamander als Tiermodell. Die Tatsache, dass Salamander wechselwarme Tiere sind und große Netzhautzellen besitzen, bietet vorteilhafte Aufnahmebedingungen, doch dieselbe Technik kann auch auf Säugetierpräparationen angewendet werden.