Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Hallo, ich bin Stefan Burani aus dem Labor von Dr. Frank Zawa am Department für Biochemie der University of California Riverside. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Chromatin-Immunpräzipitation. Beginnen wir also.

Dieses Verfahren beginnt mit der Formaldehyd-Vernetzung menschlicher embryonaler Stammzellen vor der Vernetzung. Menschliche embryonale Stammzellen werden fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius aus flüssigem Stickstoff aufgetaut und anschließend mit Medium gewaschen. Danach werden die Zellen auf mit Gelatine beschichteten Sechs-Well-Platten ausgesät und zwei bis drei Tage lang zur Expansion kultiviert.

Für jede Immunpräzipitationsreaktion benötigen wir 50 bis 100 Millionen Zellen. Die Zellen werden zunächst lysiert und in Suspension gesammelt. Frisch hergestelltes Aldehyd wird jeder Zellsuspension in einer Konzentration von 1 % zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Fügen Sie anschließend ein Zehntelvolumen von 1,25 molarer Glycin hinzu, um das Formaldehyd abzubrechen, und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Waschen Sie die Zellen zweimal mit je 10 Milliliter PBS und sammeln Sie sie dann in 50-Milliliter-Konizflaschen. Zentrifugieren Sie die Flaschen bei 1000 U/min fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die Zellen als Pellet zu sedimentieren.

Nach dem Zentrifugieren verwerfen Sie das Überstand und resuspendieren das Pellet in 1,5 Milliliter Lysepuffer. Überführen Sie die Zellen abschließend in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Übertragung der Zellen gefrieren Sie diese dreimal kurz in flüssigem Stickstoff ein und zerkleinern sie dann mit einem Gewebemörser.

Nachdem die Zellen vernetzt wurden, sind sie bereit für die Immunpräzipitation oder können unbegrenzt bei minus 80 Grad Celsius eingefroren gelagert werden. Sobald Sie die Zellen vernetzt haben, müssen Sie die magnetischen Kügelchen vorbereiten. Geben Sie 50 µL DI-Kügelchen in 1,5-mL-Mikrogefäße mit niedriger Bindungsaffinität und richten Sie ein Gefäß pro Immunpräzipitation ein.

Dann ein Milliliter Blockierungslösung hinzufügen. Sammeln Sie nun die Dialyseperlen mithilfe von Dialyse-MPC. Stellen Sie die Röhrchen auf den Magnethalter.

Lassen Sie die Kügelchen an der Seitenwand des Reaktionsgefäßes absetzen. Dies sollte etwa 15 Sekunden dauern. Sie können den Rack zweimal umdrehen, um das Sammeln der Kügelchen zu unterstützen.

Nachdem die Perlen gesammelt wurden, können Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette entfernen. Nach dem Entfernen des Überstandes fügen Sie ein Milliliter Blockierungslösung hinzu und resuspendieren die Perlen vorsichtig, indem Sie den Magneten vom Gestell nehmen und das Gestell umdrehen. Dabei können Sie den Vorgang 10 bis 20 Mal wiederholen oder so lange, bis die Perlen gleichmäßig suspendiert sind.

Suspendieren Sie die Perlen erneut, wie zuvor beschrieben. Nach dem Sammeln können Sie den Überstand mit einer Pipette entfernen. Wiederholen Sie diese Waschung mit 1,5 Milliliter Blocklösung.

Nach der zweiten Wäsche können Sie die Kügelchen in 750 Mikrolitern Blocklösung resuspendieren und anschließend 10 Mikrogramm Antikörper hinzufügen. In unserer Forschung verwenden wir einen Antikörper gegen das Protein MLL und inkubieren das Gemisch bei vier Grad Celsius für mindestens sechs Stunden oder über Nacht auf einem Mutaschüttler. Während dieser Inkubation können Sie Ihr vernetztes Chromatin sonifizieren, was wir kurz nach der Übernachtinkubation demonstrieren werden.

Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Perlen anschließend dreimal. Verwenden Sie dazu ein Milliliter Lysepuffer, wie zuvor, unter Verwendung des Magnetständer zur Sammlung der Perlen. Nach den Waschschritten können Sie Ihr gesättigtes Chromatin hinzufügen.

Bevor Sie mit der Sonifikation beginnen, müssen Sie zunächst die gefrorenen Zellpellets aus dem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank entnehmen und sie auftauen lassen. Bereiten Sie ein 15-Milliliter-Kegelrohr für die Sonifikation vor. Dies erfolgt, indem Sie das Rohr an der 5-Milliliter-Marke in zwei Teile schneiden und die obere Hälfte entsorgen.

Die Röhrchen können mit Parafilm oder mit dem Röhrchenverschluss verschlossen werden. Während des Aufbaus sollten die Röhrchen in einem Röhrchenständer so positioniert werden, dass die Ator-Sonde etwa 0,5 bis 1 cm über dem Boden des Röhrchens steht.

Stellen Sie sicher, dass die Sonde zentriert ist und die Röhrenwand nicht berührt, um Schaumbildung der Lösung zu vermeiden. Sonozierte nun die Suspension sechs Mal für jeweils 20 Sekunden. Zwischen den Sonozierrunden sollte jede Probe in einem Eiswasserbad aufbewahrt werden, um die Schaumbildung zu verringern.

Stellen Sie zunächst die Leistungsabgabe auf null ein und erhöhen Sie diese dann manuell auf die endgültige Leistung während des ersten Pulses. Nach einer gewissen Einwirkzeit überführen Sie das Material in ein 1,5-Milliliter-Gefäß und zentrifugieren es 10 Minuten bei 13.000 U/min und 4 Grad Celsius. Um den Pellet mit dem Zelltrümmer zu erhalten und die sna zu gewinnen.

Überführen Sie das SINA in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Heben Sie 50 Mikroliter des Zelllysats von jeder Probe als Input-DNA auf. Dies wird später verwendet, um die Größe des gemeinsamen Chromatins zu überprüfen.

Dies kann bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Pro Charge des beschallten Lysats sollte mindestens ein Aliquot der Eingabe-DNA aufbewahrt werden. Nun sind wir bereit, das Chromatin durch Immunpräzipitation anzureichern, um das Chromatin anzureichern.

Fügen Sie zunächst das Chromatinäquivalent von 50 bis 100 Millionen Zellen aus dem im vorherigen Schritt gesammelten Sating zu 50 µL Antikörper-Magnetpartikel-Mischung, die zuvor hergestellt wurde, hinzu, sodass sich ein Endvolumen von einem Milliliter ergibt. Gegebenenfalls kann dieses Volumen mit Lysepuffer invertiert angepasst werden, um eine Resuspension zu ermöglichen. Die Partikel inkubieren diese Mischung über Nacht auf dem Mutator bei vier Grad Celsius.

Nach der Inkubation sammeln Sie die Kügelchen mit dem Dyl-MPC, indem Sie die Röhrchen in das Gestell stellen und die Kügelchen an der Röhrchenwand abscheiden lassen. Dies sollte anschließend etwa 20 Sekunden dauern. Klopfen Sie das Gestell zweimal leicht an, um sicherzustellen, dass sich alle Kügelchen gesammelt haben.

Entfernen Sie anschließend den Überstand mit einer Pipette, wobei zwischen den Proben die Spitzen gewechselt werden. Als Nächstes müssen die Perlen gewaschen werden. Dazu fügen Sie je ein Milliliter Lysepuffer zu jedem Röhrchen hinzu und resuspendieren die Perlen vorsichtig.

Dies kann durch Entfernen des Magneten vom Rack und durch 10 bis 20faches Umstülpen des Racks mit den darin befindlichen Reaktionsgefäßen oder bis zur gleichmäßigen Rückaufschlämmung der Partikel erfolgen. Danach sammeln Sie die Partikel durch Wiedereinsetzen des Magneten. Entfernen Sie die Flüssigkeit mittels Pipette.

Wiederholen Sie diese Waschung drei bis fünf weitere Male. Denken Sie daran, zwischen den Waschungen die Spitzen zu wechseln. Waschen Sie die Kügelchen anschließend vier bis sechs Mal in einem Milliliter IP1-Puffer, wie gerade beschrieben.

Danach die Kügelchen ebenso vier bis sechs Mal mit je einem Milliliter IP2-Puffer waschen. Zum Schluss die Kügelchen vier bis sechs Mal mit je einem Milliliter TE-Puffer, pH 8,0, waschen, wie bei den anderen Waschungen durchgeführt. Nach der letzten Waschung den TE-Puffer entfernen.

Jetzt dreimal Sieben Minuten bei drei Grad Celsius mit 3000 U/min zentrifugieren, um jeglichen Rest an TE-Puffer zu entfernen. Die Kügelchen sind nun bereit für die Elution, um das Chromatin zu gewinnen. Geben Sie zunächst 210 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und eluieren Sie das Material von den Kügelchen, indem Sie die Röhrchen 15 Minuten oder bis zu 30 Minuten in einem thermischen Mischer bei 65 Grad Celsius und 800 U/min inkubieren, um die Ausbeute der Eluate zu verbessern.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 13.000 U/min für eine Minute. Nach der Zentrifugation entfernen Sie 200 Mikroliter der S-Nain-Fraktion und überführen sie in ein neues Röhrchen. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter TE 0,0 hinzu. Nun sind Ihre Proben bereit für CROs, um die reversen Vernetzungen der präzipitierten DNA durchzuführen.

Inkubieren Sie das Überstand in einem Wasserbad mit 65 Grad Celsius für mindestens sechs Stunden und maximal 15 Stunden. Diese Inkubation kann in einem Wasserbad durchgeführt werden, um Kondensation zu minimieren. Danach folgen Sie der 50 Mikroliter Eingabe-DNA.

Dies wurde reserviert, nachdem die Reverse-Vernetzung der Input-DNA nach der Sonikation durch Inkubation bei 65 Grad Celsius erfolgte, wie zuvor mit dem Eluat durchgeführt. Nun sind wir bereit, die DNA zu reinigen. Die DNA wird anschließend mittels Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt und anschließend durch Ethanolpräzipitation angereichert.

Die präzipitierten DNA-Pellets werden in Wasser resuspendiert und können dann bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Zur späteren Verwendung kann die gereinigte Input-DNA in einem Agarose-Gel laufen, um die Größe des geschnittenen Chromatins zu überprüfen. Ideal sollte das Fragment zwischen 250 und 750 Basen liegen.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Chromatin-Immunpräzipitation aus menschlichen embryonalen Stammzellen durchführt. Bei der Durchführung dieses Experiments ist es wichtig, einen hochaffinen Antikörper für Chromatin im richtigen Größenbereich sowie Waschschritte mit hoher Stringenz zu verwenden. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.