Name: Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen durch Anwendung von Fluoro-Gold auf der Oberfläche des Colliculus superior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Lernen Sie die retrograde Markierung retinaler Ganglienzellen mittels Fluoro-Gold auf dem Colliculus superior. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung neuronaler Bahnen und die Bewertung von Medikamenteneffekten auf das Zellüberleben.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung von National Glaukom-Programm der amerikanischen Health Assistant Foundation danken.

<ol><li> Betäuben die Ratte durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80mg/kg) und Xylazin (8mg/kg) (Volumen-Verhältnis bei 2:1). Bewerben sterile Auge Schmiermittel Salbe zu verhindern Trocknung der Hornhaut während der Operation. </li><li> Shave den Kopf Pelz (von Auge zu Ohr-Ebene) und fixieren Sie den Kopf auf den Kopf der Bühne durch einen Kopf Klammer und setzen Sie seine Schneidezähne im Schneidezahn bar. </li><li> Desinfiziert den Betrieb mit 10% Povidon-Iod-Lösung um 70% Alkohol. </li><li> Schneiden Sie die Haut und Muskeln, um Schädel und Nähte (sagittalen, koronalen und transversalen Nähte) (Abbildung 1) aussetzen. Wenden Sie Schmerzmittel, Bupivacain als Spritzschutz an Schnitt-Bereich (nicht auf 2 mg / kg nicht überschreiten). </li><li> Bohren Sie ein Schädel-Loch (ø 2x2 mm, 0,5 mm von beiden sagittalen und transversalen Nähte) auf jeder Seite der Pfeilnaht. Vermeiden Bruch der Hirnhaut und des Sinus liegt unterhalb der Nähte. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="Markenzeichen auf Leben Ratte Schädel." width="469" height="317" /> Abbildung 1. Markenzeichen auf Leben Ratte Schädel. </li><li> Schneiden Sie die Hirnhaut durch die Feder Schere, nicht reißt. </li><li> Saugen Sie die zerebrale Inhalte, die über die dorsale Oberfläche des Colliculus superior sorgfältig von der Vakuumpumpe und drei Check-Punkte beobachtet werden können liegt: <ol><li> die Farbe des Hirngewebes wechselt von grau zu weiß bis grau </li><li> Stop Absaugen, wenn die farblose Liquor herauskommen </li><li> vergrößert vorsichtig die niedrigste Saugleistung horizontal auf die gelbliche Colliculus superior von der Dura bedeckt aussetzen </li></ol></li><li> Absaugen des Gehirns Inhalte über SC bis vier Kanten des SC direkt unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. Der Anteil der Hirnrinde entfernt auf ein Minimum begrenzt werden, um unerwünschte Nebenwirkungen (zB motorische Störungen) zu vermeiden. Achten Sie darauf, den Sinus zu berühren. </li><li> Nehmen Sie die Flüssigkeit in das Loch mit feinen sterile Baumwolle Streifen, um die Oberfläche der SC so trocken wie möglich. Legen Sie dann eine dünne Schicht von Gelatine Schwamm mit Wasser befeuchtete mit 6% Fluoro-Gold auf der Oberfläche der SC (FG wird durch das Axon-Terminals von retinalen Ganglienzellen genommen und bilateral retrograd seiner SOMAS in der Netzhaut transportiert). </li><li> Füllen Sie das Loch mit Gelschaum und schließen Sie die Hautwunde mit Klammern für chirurgische Nähte. </li><li> Die Tiere durften unter Glühlampe warm zu halten erholen. Analgetikum, Buprenorphin (100mcg/kg) wird oral im Trinkwasser für 5 Tage nach SC Kennzeichnung angewendet. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol><li> Warum Sie diese OP-Methode für retinalen Ganglienzellen zu zählen? In Ratten etwa 98% der retinalen Ganglienzellen (RGC) ist bekannt, dass auf der Gegenseite Colliculus superior (SC)-Projekt. Anwenden von Fluor-Gold auf der Oberfläche der SC können fast alle Label der RGCs, so dass wir auf diesem am stärksten gefährdeten retinalen Neurons in Glaukom konzentrieren können. Vergleichen mit retrograde Markierung von RGC indem FG am Stumpf des durchtrennten Sehnerven für 2 Tage, ist die Einmischung der RGC Überleben minimiert. ...

retrograde markierung von retinalen ganglienzellen durch anwendung von fluoro-gold auf der oberfläche des colliculus superior

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

Retinalen Ganglienzellen (RGC) Zählen ist notwendig, um die Degeneration der Netzhaut vor allem bei Glaukom zu bewerten. Zuverlässige RGC Kennzeichnung ist von grundlegender Bedeutung für die Beurteilung der Auswirkungen der Behandlung. Bei Ratten beträgt ca. 98% der RGCs bekannt, zur kontralateralen Colliculus superior (SC) (Forrester und Peters, 1967) Projekt. Anwenden von Fluor-Gold (FG) auf der Oberfläche der SC-Label fast alle RGCs, so dass wir auf diesem am stärksten gefährdeten retinalen Neurons in Glaukom konzentrieren können. FG wird durch das Axon-Terminals von retinalen Ganglienzellen genommen und bilateral retrograd seiner SOMAS in der Netzhaut transportiert. Vergleichen mit retrograde Markierung von RGC indem FG am Stumpf des durchtrennten Sehnerven für 2 Tage, ist die Einmischung der RGC Überleben minimiert. Vergleichen mit Kresylviolett-Färbung, die Flecken RGCs, Amakrinzellen und Endothel der Blutgefäße in der Netzhaut Ganglienzellen, diese Kennzeichnung Methode genauer auf die RGC ist. Dieses Video beschreibt die Methode der retrograden Markierung von RGC indem FG auf der Oberfläche des SC. Das chirurgische Verfahren umfassen das Bohren der Schädel; Absaugen der Rinde in den SC aussetzen und die Anwendung Gelatineschwamm über den gesamten dorsalen Oberfläche des SC gezeigt. Nützliche Tipps zur Vermeidung von massiven Hirnblutungen und Streben des SC gegeben worden.

Dieses Video beschreibt die Methode der retrograden Markierung von RGC indem Fluor-Gold (FG) auf der Oberfläche des Colliculus superior (SC). Technik umfasst das Bohren des Schädels, das Absaugen des Kortex, und die Anwendung Gelatineschwamm über den gesamten dorsalen Oberfläche des SC.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen durch Anwendung von Fluoro-Gold auf der Oberfläche des Colliculus superior

Die Zählung von retinalen Ganglienzellen (RGC) ist essenziell für die Bewertung der retinalen Degeneration, insbesondere bei Glaukomen. Eine zuverlässige RGC-Markierung ist grundlegend für ...

Hallo, ich bin Tu vom GOSO-Labor an der Universität von Hongkong. Heute werde ich vorstellen, wie man eine retrograde Markierung der Netzhautganglienzellen beim Ratten durchführt.Retinalganglienzellen werden retrograd mit einem Farbstoff markiert, indem der Farbstoff auf die Oberfläche des oberen Hügels aufgetragen wird, sodass später die Anzahl der Retinalganglienzellen auf der flach präparierten Netzhaut gezählt werden kann, um den Zelltod oder die Wirkung eines applizierten Medikaments zu bewerten. Dies ist eine Abbildung, die den Weg von der Netzhaut zum oberen Hügel veranschaulicht. CLE-Fluoreszenzfarbstoff kann retrograd vom oberen Hügel entlang des Sehnervbündels transportiert werden.Kreuzen Sie das Chiasma opticum über den Sehnerv bis zur Netzhaut im Auge. Wir verwenden ein Operationsmikroskop, um die Operation durchzuführen. Willkommenspumpe zum Aspirieren der Großhirnrinde über der dorsalen Oberfläche der CLE-Kopfhalterung, um den roten Hut in Position zu halten.Ke und Sinus zur Fixierung der Rattensäge für das Öffnen der Schädeldecke und absorbierbare Jealousy-Pon zur Applikation des fluoreszierenden Farbstoffs FG auf der Oberfläche von klicklos. Die Instrumente wurden vor dem Eingriff autoklaviert, einschließlich feiner Pinzette, Feder-Schere, Vakuumnadel, Bohrerspitze und Nahtclips. Chirurgisches Skalpell zum Schneiden der Haut, Lineal zur Messung und Watte befinden sich ebenfalls in sterilisiertem Zustand.Wir analysieren das Rote durch tonale Injektion von Ketamin und Sine-Gel. Nach dem Rasieren des Bereichs von der Augenhöhe bis zur Höhe der Ohren desizierten wir die Operationsstelle mit Propanjod, gefolgt von 70 %igem Alkohol. Anschließend brachten wir die rote Haube in Position auf dem Kopfhalter.Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie des Kopfes auf, beginnend auf Augenhöhe bis zur Höhe der Ohren. Dadurch erhalten wir eine gute Sicht auf die frontale Naht, die sagittale Naht, die transversale Naht, hier befindet sich das BMA und hier liegt das Lambda. Markieren Sie die Schraube 0,5 bis 1 Millimeter von der AL-Ende-Transfernaht entfernt und beschriften Sie sie anschließend auf beiden Seiten erneut, um sicherzustellen, dass die Markierung mindestens 0,5 Millimeter von den Nähten entfernt ist.Dann können wir beginnen, ein Loch entlang der Markierungsseite zu bohren, und die Geschwindigkeit sowie Richtung des Bohrers so kontrollieren, dass sich eine ausgedehnte Ruptur der Hirnhäute und der Sinusauskleidung unterhalb der Naht bildet. Beenden Sie das Bohren, wenn der Durchmesser etwa zwei Millimeter beträgt. Danach beginnen wir erneut auf der gegenüberliegenden Seite, um sicherzustellen, dass das Loch die richtige Größe und Position aufweist.Schneiden Sie die Hirnhäute mit der Federpinzette auf, verwenden Sie eine feine Pinzette, um Knochenreste im Loch zu entfernen. Nun können wir die Aspiration mit der Vakuumpumpe beginnen. Die erste Schicht des BR ist die grüne Substanz, die erneut zusammen mit den Hirnhäuten durchtrennt wird.Dann können Sie sehen, wie sich die Farbe der T-Zelle zu Weiß verändert. Dies ist also die weiße Substanz des Sero. Führen Sie die Aspiration schön langsam durch.Jetzt können wir die graue Substanz wieder erkennen. Die Farbe wird weniger weiß. Sie können sehen, dass sie unten grau ist.Ich verstehe. Sie können dort sehen, wie die klare Zerebrospinalflüssigkeit austritt. Das bedeutet, dass wir die dorsale Oberfläche des oberen Corpus erreicht haben.Erneut zeigt sich an dieser Ebene ein vergrößerter Defekt. Ganz unten erkennen wir die gelbliche Farbe der Dura, die den oberen Clusterteil bedeckt. Führen Sie an dieser Stelle eine horizontale Aspiration durch, um den Inhalt des oberen Clusterteils nicht zu beschädigen.Dann können wir als Ganzes beginnen. Sie sehen die grüne Substanz. Es ist tatsächlich grüne Farbe.Dann gelangen wir zum weißen Mark. Die Gewebefarbe ist weiß. Nun können Sie sehen, wie sich das CSF so schön unterhalb der grauen Farbe befindet.Entfernen Sie diese letzte Schicht des grauen Marks, sodass die gelbe Dura freigelegt wird. Achten Sie darauf, die Dura über den einzelnen Clickern vorsichtig zu öffnen und die Öffnung zu vergrößern. Stellen Sie sicher, dass unter dem Mikroskop der gesamte Rand der Clicker sichtbar ist.Halten Sie die Kopfklammer der Kopfhalterung in verschiedenen Winkeln und führen Sie einige abschließende Aspirationen durch, bis die vier Kanten des CLE direkt unter dem Mikroskop sichtbar sind. Saugen Sie die Flüssigkeit in der Öffnung mit einem feinen Wattestreifen auf, um die Oberfläche des CLE so stabil wie möglich zu machen. Nehmen Sie ein Stück Gelatine, das zuvor mit 6 % Goldfärbemittel beschichtet wurde, und teilen Sie es in gleichmäßige Stücke auf.Bringen Sie es zu einer dünnen Schicht auf, deren Größe etwas größer ist als die gesamte dorsale Fläche des oberen Teils. Legen Sie es vorsichtig auf die Oberfläche der oberen Klötzchen und dann auf die gegenüberliegende Seite. Platzieren Sie es innerhalb des Lochs, wobei die gesamte Oberfläche des Clus bedeckt sein muss. Führen Sie es durch die Löcher mit zunehmendem Ausstoßen.Schließen Sie schließlich die Hautwunde mit Nahtclips, reinigen Sie die Wunde nach der Operation, stellen Sie das Tier in einen sauberen Käfig zurück und lassen Sie es sich erholen. Halten Sie warme Bedingungen ein. Das Tier verhält sich nach der Operation im wachen Zustand normal.Sieben Tage nach der SC-Markierung dissezieren wir die Netzhaut und montieren sie flach, anschließend zählen wir die retinalen Ganglienzellen und das Epinalmikroskop mithilfe eines UV-Filters. Da 98 % der retinalen Ganglienzellen zur oberen Hügelregion projizieren, ist eine zuverlässige ST-Markierung entscheidend für die Beurteilung des Krankheitsverlaufs und der Wirkung von Arzneimitteln. Dies ist ein Beispiel für retrograd markierte retinale Ganglienzellen auf einer flach montierten Netzhaut.

retrograde-labeling-retinal-ganglion-cells-application-fluoro-gold-on

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Optic Nerve Durchtrennung ist eine weit verbreitete Modell der erwachsenen ZNS-Verletzung. Neunzig Prozent der retinalen Ganglienzellen (RGC), deren Axone sind vollständig durchtrennt (Axotomie) sterben innerhalb von 14 Tagen nach Axotomie. Dieses Modell ist leicht zugänglich experimentelle Manipulationen und hoch reproduzierbar.

Optic Nerve Durchtrennung: Ein Modell des Adult Neuron Apoptose in das zentrale Nervensystem

Optic Nerve Durchtrennung ist eine weit verbreitete Modell der erwachsenen ZNS-Verletzung. Dieses Modell ist ideal für die Durchführung einer Reihe von experimentellen Manipulationen, die die Netzhaut Ziel global oder direkt auf den verletzten neuronalen Population von retinalen Ganglienzellen.

Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet...

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

Quelle: Inal, M. A. et. al., Retrograde Verfolgung von Drosophila embryonalen Motoneuronen unter Verwendung lipophiler fluoreszierender Farbstoffe. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die Methode der retrograden Markierung von Drosophila Motoneuronen unter Verwendung lipophiler Farbstoffe. Der Farbstoff dringt in das Axon ein, wandert rückwärts und markiert die Neuronen grün, was eine detaillierte Visualisierung ihrer Morphologie und Projektionen unter einem konfokalen Mikroskop ermöglicht.

Retrograde Markierung von Drosophila-Motoneuronen mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen

Source: Laboissonniere, et. al. Einzelzell-RNA-Seq definierter Untergruppen von retinalen Ganglienzellen. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video zeigt eine Fluoreszenzverfolgungstechnik zur Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen (RGC) in einer transgenen Mausnetzhaut. Der Prozess umfasst die Sicherung der isolierten Netzhaut in einer Aufnahmekammer, die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit durch sauerstoffhaltige Perfusion und das Targeting fluoreszenzmarkierter RGCs mit...

Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen der Maus durch Fluoreszenzverfolgung

Wir stellen eine effiziente Methode zur retrograden Markierung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) in adulten Zebrafischen vor.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

Die Postembedding-Immunogold-Methode ist eine der effektivsten Methoden, um hochauflösende Analysen der subzellulären Lokalisation spezifischer Moleküle zu liefern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Analyse von Glutamatrezeptoren an retinalen Bandsynapsen.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Millionen von Menschen leiden an retinalen degenerativen Erkrankungen, die zu irreversibler Blindheit führen. Ein gemeinsames Element vieler dieser Krankheiten ist der Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Isolierung von primären murinen RGCs durch positive und negative Selektion mit Durchflusszytometrie.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Sekundäre Degeneration der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors) tritt häufig bei Glaukom. Diese Studie beschreibt eine innovative operative Vorgehensweise für partielle Sehnerv Durchtrennung. Die Verwendung dieses platzsparende operativen Ansatzes erstreckt sich das Modell Einsatzbereich und ermöglicht Erforschung der sekundären Verletzungen Mechanismen in Routinggruppenconnectors in einer neuen Weise.

Partielle Sehnerv Durchtrennung bei Ratten: ein Modell gegründet mit einem neuen operativen Ansatz zur sekundären Degeneration der retinalen Ganglienzellen bewerten

Lernen Sie die retrograde Markierung retinaler Ganglienzellen mittels Fluoro-Gold auf dem Colliculus superior. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung neuronaler Bahnen und die Bewertung von Medikamenteneffekten auf das Zellüberleben.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen durch Anwendung von Fluoro-Gold auf der Oberfläche des Colliculus superior

Weitere Videos entdecken