Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

Hallo, ich bin Lauren Frank aus dem Labor von Emmanuel Pothos am Department für Pharmakologie und Experimentelle Therapeutik an der Medizinischen Fakultät der Tufts University. Und ich bin Emmanuel Pothos. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erzeugung primärer dopaminerger Zellkulturen aus dem Mittelhirn von neonatalen Nagetieren.

Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Vorbereiten von Werkzeugen und Reagenzien, Dissektion des Mittelhirns von P0 bis P2-Rodentienhirnen, Trennen der Hirnsegmente und Aufbringen der dissoziierten Neuronen. Beginnen wir also.

Bei diesem Verfahren müssen eine Reihe von Vorbereitungsschritten zwei bis drei Wochen vor der Erzeugung der Dopaminneuronen-Kultur durchgeführt werden. Gliazellen müssen ausgesät werden, damit sie Zeit haben, sich zu vermehren und den Boden der Kulturschalen vollständig zu bedecken. Die primären Dopaminneuronen werden ein bis sieben Tage vor der Kultivierung der primären neuronalen Zellen auf einer Einschicht aus Gliazellen kultiviert. Entfernen Sie das Medium von den Gliazellen und ersetzen Sie es am Tag vor der AC-Kultivierung durch zwei Milliliter frisches neuronales Medium. Alle Materialien mit Ausnahme der dissektionsinstrumente müssen mittels UV-Licht sterilisiert werden, einschließlich 12 Dissektionsplatten.

Zwei Dissociationsgefäße mit einem mikromagnetischen Rührstab. Zwei Gefäßverschlüsse mit jeweils zwei kleinen Löchern in der Oberseite. Verschobene Ringe auseinandergelegt.

Und die Objektträgerbox – denken Sie daran, sie geöffnet zu lassen. Alle diese Werkzeuge werden vor Beginn am Tag der Kultivierung mit 70 %igem Ethanol beschichtet. Nehmen Sie zunächst alle Bestandteile für die Pepane-Lösung, die verwendet wird, um die primäre Neuronenlösung aus dem Gefrierschrank zu entnehmen, und lassen Sie sie auftauen.

Richten Sie ein Heizgerät ein, um einen Becher mit Wasser auf 34 Grad Celsius zum Verdauen zu erhitzen, und bereiten Sie mit Carbogen gesättigtes Wasser zur Sauerstoffversorgung der Pepan-Lösung vor. Während des Verdauungsvorgangs werden 15 sterile Röhrchen mit vier bis sechs Milliliter steriler PBS zum Waschen der Gehirne vor der Dissektion vorbereitet und auf Eis gestellt. 20 bis 30 Milliliter frisches neuronales Medium werden abgemessen und in den Inkubator gestellt.

Anschließend wird das Dissoziationsgefäß vorbereitet, indem mit einer sterilen Umkipp-Filtrationseinheit die Pepan-Lösung filtriert wird, die dann mit einem 25-Milliliter-Streptokap in das Dissoziationsgefäß überführt wird; fügen Sie eine sterile Spritze ein, stechen Sie ein Loch in den Verschluss, der mit einem 0,2-Mikron-Filter verbunden ist. Schließen Sie das Carbogen an den Filter an und sichern Sie es mit Parafilm. Stellen Sie das Gefäß in die Styroporscheibe.

Sobald das Dissoziationsfläschchen eingesetzt ist, sicherstellen, dass sich der Magnetraührer bewegt. Das Gas strömt in das Fläschchen ein, und die Temperatur hat sich bei 34 Grad Celsius stabilisiert. Das Präparationsmikroskop wird in den Abzug gebracht, und die Präparationsinstrumente werden auf einer Aluminiumfolie ausgelegt.

Legen Sie dann ein großes Quadrat Aluminiumfolie und 12 kleinere Quadrate aus. Lassen Sie eine Schere für Enthauptungen zusammen mit der Aluminiumfolie liegen. Stellen Sie eine Styroporschachtel mit Eiswasser außerhalb des Abzugs auf.

Bereiten Sie anschließend das Anästhetikum vor, das aus einer Mischung von 0,075 Milliliter Ketamin und 0,075 Milliliter Xylazin besteht. Danach sollten mindestens 12 P0 bis P2-Welpen für 135-Millimeter-Platten mit einem 23-Millimeter-Glas beschafft werden. Bei Mäusen muss sichergestellt werden, dass das gesamte Wurf eine genetische Übereinstimmung aufweist.

Wenn das Genotyp unbekannt ist, müssen Zellen von jedem Tier auf separaten Schalen ausgestrichen werden, und es müssen genaue Aufzeichnungen geführt werden, um die Zellen später mit den Genotypergebnissen zuordnen zu können. Um die Dissektion zu beginnen, betäuben Sie das erste Tier durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin Xylazin. Wenn das Tier nicht auf einen Schwanzreflex-Test reagiert, legen Sie es 30 Sekunden lang in Eiswasser, bis es hypotherm ist.

Danach eine kleine Aluminiumfolie mit 70 % Ethanol spülen, die Dekapitationsschere und den Tierkopf abwischen, um eine Kontamination des Gehirngewebes während der Sektion zu vermeiden; den Kopf mit der Schere abtrennen, sodass er auf das Aluminiumfolienstück fällt, und ihn unter den Abzug schieben. Das Gehirn vorsichtig entnehmen, indem zunächst mit der kleinen Schere die Haut durchtrennt wird, um den Schädel freizulegen. Den Schädel ringsherum um 360 Grad durchschneiden.

Danach mit einer Pinzette die Schädelkalotte abziehen. Das Gehirn mit einem kleinen Spatel aus dem Schädel heben und in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit Eis geben. Kalte PBS – das Röhrchen vor dem Entfernen des nächsten S-Gehirns wieder auf Eis stellen.

Wiederholen Sie die Dissektionen, bis sich drei Gehirne in separaten Röhrchen auf Eis befinden. Gießen Sie ein Gehirn und PBS auf die erste Dissektionsplatte. Platzieren Sie das Gehirn unter dem Mikroskop auf einer Unterlage aus Sill-Guard-Kleber als Polster, damit die Klinge scharf bleibt.

Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Segmente in ein frisches Röhrchen mit PBS zu geben, um die Segmente zu waschen, bevor Sie sie in die Pepane-Lösung überführen. Starten Sie eine Stoppuhr, sobald die ersten Segmente hinzugefügt werden, und setzen Sie die Präparationen fort, bis alle Gehirne digeriert werden. In Pap-Schmerz.

Die ersten Gehirnsegmente werden etwa eine Stunde lang verdaut haben. Bis die letzten Segmente hinzugefügt sind, sollte die Verdauung noch eine weitere Stunde lang fortgesetzt werden. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur im Pepanbad bei 34 Grad Celsius stabilisiert ist.

Um den Inkubationsschritt zu beginnen, verwenden Sie eine Transferpipette, um die Gehirnsegmente in ein steriles 15-Milliliter-Gefäß zu geben. Versuchen Sie, überschüssige Pepanlösung zu vermeiden. Falls dies dennoch geschieht, entfernen Sie die überschüssige Pepanlösung.

Anschließend spülen Sie die Segmente, indem Sie zwei Milliliter vorgewärmtes neuronales Medium aus dem Inkubator hinzufügen. Lassen Sie die Segmente absetzen und entfernen Sie vorsichtig so viel Lösung wie möglich, ohne die Segmente zu stören. Führen Sie insgesamt drei Waschschritte durch.

Denken Sie daran, zwischen den Waschschritten die Pipetten zu wechseln, um eine Kontamination zu vermeiden, indem Sie eine neue Pipettenspitze verwenden. Beginnen Sie die Wiederholungen in zwei Millilitern neuronalem Medium. Pipettieren Sie 25-mal, vermeiden Sie dabei Luftblasen.

Anschießend lassen Sie die nicht assoziierten Segmente drei Minuten lang absetzen. Sammeln Sie mit einer Transferpipette so viel Überstand wie möglich, ohne die Segmente am Boden zu stören. Bewahren Sie den Überstand in einem neuen sterilen 15-Milliliter-Röhrchen auf.

Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze und anschließend mit einer 200-Mikroliter-Spitze, wobei die Segmente optisch vollständig dissoziiert erscheinen sollten. Das Überstandvolumen aller Schritte wird in demselben 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Wir sind bereit, die Zellen abzupipettieren und schließlich 10-mal mit einer Transferpipette zu mischen, um eine homogene Zellsuspension für die Zellzählung zu erhalten.

Unter Verwendung einer sterilen gelben Pipettenspitze, die jede Spitze der Pinzette abdeckt. Vorsichtig einen Objektring so zentral wie möglich auf das Glas fallen lassen. In jedem Gefäß werden diese Ringe dazu verwendet, einen Bereich innerhalb der Kulturschale abzugrenzen, in dem die Neuronen ausgesät werden.

Verwenden Sie die Pipettenspitze, um Ringe über die mittlere Vertiefung jedes Dishes zu schieben. Geben Sie vorsichtig das entsprechende Zellvolumen zum Dish hinzu. Fügen Sie die Zellen in die Mitte des Rings hinzu, den Sie bereits im Dish platziert haben.

Denken Sie daran, für jede Schale die Pipettenspitzen zu wechseln. Als Nächstes geben Sie hundert Mikroliter verdünnte GDNF-Lösung so nahe wie möglich am äußeren Rand jeder Schale hinzu, um die Proliferation der Neuronen zu unterstützen. Danach wird der Mitoseinhibitor Fluoro-Dioxydin oder FDU außerhalb des Rings zugegeben, um ein Überwachsen durch Gliazellen zu verhindern.

Pipettenspitzen werden häufig in den Inkubator zurückgebracht, und die Zellen werden am nächsten Tag über Nacht zur Sedimentation belassen. Unter Verwendung steriler Pipettenspitzen werden die Spitzen der Pinzette abgedeckt, die Ringe entfernt, die Schalen in den Inkubator zurückgebracht und bis zum Zeitpunkt der Experimente so wenig wie möglich gestört. Überprüfen Sie die Schalen täglich auf mögliche Kontaminationen, und falls Kontaminationen beobachtet werden, entfernen Sie die betroffenen Schalen unverzüglich. Die Kulturen sind innerhalb von drei Wochen zur Verwendung in Elektrophysiologie-, Molekularbiologie-Experimenten und immunzytochemischen Analysen bereit.

Nun, da die Zellen ausplattiert wurden, betrachten wir einige repräsentative Beispiele der Zellen in Kultur. Hier sehen wir eine Primärkultur, die vor 14 Tagen ausplattiert wurde. Dies ist ein Beispiel für eine gute Kultur, da deutlich erkennbare Zellkörper mit von ihnen ausgehenden Fortsätzen sichtbar sind.

Stellen Sie außerdem das Fehlen jeglichen Schimmelpilz- oder Pilzwachstums in der Petrischale fest, das auf eine Kontamination hindeuten würde. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man primäre dissoziierte dopaminerge Zellkulturen aus dem Mittelhirn von neonatalen Nagetieren erzeugt. Bei dieser Methode ist es wichtig, einen sterilen Arbeitsbereich beizubehalten, ausschließlich neonatale Tiere im Alter von P null bis P zwei zu verwenden, die Zellen auf gesunden glialen Substraten mit glial konditioniertem Medium zu platzieren und eine gleichmäßige Ansiedlungsdichte einzuhalten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.