Name: Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) auf Matrigel ohne Fütterzellen. Diese Methode zeigt das kontinuierliche Passagieren und die Pluripotenzbestätigung mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Menschliche embryonale Stammzellen-Studien in der Teitell Labor werden von einem California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Saatgut gewähren RS1-00313 unterstützt. Wir danken Mitglieder der Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, vor allem Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, und die Mitglieder des UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility für ihre Unterstützung unserer Studien.

hESC Kultur tägliche Wartung <ol><li> hESC Kulturmedien müssen alle 24 Stunden gewechselt werden. Von der ES Medien Vorratsflasche bei 4 ° C gelagert, nehmen Sie die Menge der Lösung benötigt werden (~ 20ml pro 6-well-Platte), in einem 50ml Falcon-Röhrchen und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. Nachdem die Medien wird erwärmt, fügen bFGF Lagerung bei 4 ° C bis zu einer Endkonzentration von 10ng/ml. Legen Sie die bFGF Aktie wieder bei 4 ° C sofort nach Gebrauch! </li><li> Entfernen Sie aus dem 6-Well-Platten alle, aber ~ 500μl der Medien. Vergewissern Sie sich, wirbeln die Kulturschale zu Schutt zu entfernen auszusetzen. Sicherstellen, dass die bFGF in der hESC Kulturmedien wird gründlich gemischt und fügen 3 ml frisches Medium zurück in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator. </li></ol> Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel Normalerweise wird eine konfluente 6-Well-Platte von hESCs auf MEFs können von 1.02 Uhr bis 01.03 Uhr aufgeteilt werden auf Matrigel 6-well Platten mit den Vertiefungen zu konfluenten wieder 4-5 Tage nach der Trennung. <ol><li> Bei der Aufteilung hESCs auf Matrigel, MEF-konditionierte Medien (CM) wird verwendet, um zu halten Pluripotenz. MEF-konditionierten Medien erfolgt im Voraus. Am ersten Tag werden 1,5 × 10 7 γ-bestrahlten MEFs in eine T75 ausgesät. Am zweiten Tag sind MEFs einmal mit Raumtemperatur 1 × PBS, pH 7,4 gewaschen und anschließend 15 ml ES-Medien mit 5ng/ml bFGF ergänzt wird, um den Kolben gegeben. (HINWEIS: MEFs kann in kleineren oder größeren Kolben beschichtet werden, sondern Verhältnis zwischen Zelldichte und das Volumen der ES Medien sollten konstant sein.) Der Kolben bei 37 ° C wird für weitere 24 Stunden inkubiert. Am dritten Tag ist der CM gesammelt und mit 15 ml frischem ES-Medien mit 5ng/ml bFGF ergänzt ersetzt. Die gesammelten CM ist bei 4 ° C gelagert MEF-konditionierten Medien von einer Beschichtung von MEFs sind über sieben aufeinander folgenden Tagen geerntet bis 15 x 7 = 105ml generieren. Nach sieben Tagen sind alle CM Fraktionen vereinigt, sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 ° C. CM Media hergestellt, wie können gespeichert beschrieben und verwendet werden für 1 Monat. </li><li> Einen Tag vor hESC Splitting, legte Matrigel Aliquots in Eppendorf-Röhrchen bei 4 ° C auftauen über Nacht (ein Aliquot enthält 76.2mg von Matrigel, und dies ist der Betrag für eine 6-Well-Platte erforderlich). Am Tag der Aufspaltung, nehmen Sie eine Flasche des aufgetauten Matrigel für eine 6-Well-Platte, legen Sie die Flasche und 6ml der kalten DMEM/F12 Medien auf Eis. Übertragen Sie die Matrigel in die DMEM/F12 Medien und gut mischen. 1ml der Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Schwenken Sie die Platte auf Matrigel auf der Oberfläche verteilen und inkubieren Sie die Matrigel-bedeckten Platte bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde vor der Spaltung der hESCs. </li><li> hESCs auf MEFs werden einmal mit 1 × PBS, pH 7,4 gewaschen. Anschließend 1ml warmen Kollagenase IV (1mg/ml) in jede Vertiefung der 6-well-Platte gegeben und dann wird die Platte bei 37 ° C für 5-10 min. </li><li> 1ml von ES Medien ohne bFGF in jede Vertiefung. Verwenden Sie eine 1ml Pipette auf die Stammzellen von der Platte zu blasen. Sammeln Sie alle Medien mit Klumpen von hES und tote MEFs in ein 50ml Falcon-Röhrchen. Lassen Sie große Klumpen von Zellen für 5-10 Minuten absetzen, so dass die hESC Klumpen ein Pellet Formular am Ende der Röhre, während die MEFs im Überstand suspendiert bleiben. Überstand verwerfen, und waschen durch Resuspendieren des hESC Pellet mit ES Medien fehlt bFGF, durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 200g folgte für 5 min. </li><li> Um Platte die Stammzellen auf Matrigel Platten ersten Waschen die Matrigel-Platten mit Raumtemperatur DMEM/F12 (1 ml pro well) und das Hinzufügen von 2,5 ml CM mit 10ng/ml bFGF pro Vertiefung ergänzt. Das Pellet in einem geeigneten Volumen von CM mit 10ng/ml bFGF, Pipette die Zellsuspension nach oben und unten mehrfach ergänzt, bis die Klumpen einheitlichen und klein geworden. Aliquot der Suspension bei 0,5 ml pro Vertiefung auf dem Matrigel Platte. Beachten Sie, dass die Kolonie Dichte auf Matrigel höher als die Dichte der Kolonien, die von üblichen Aufteilung auf MEFs ist. Die Platte wird in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Zur Aufrechterhaltung der hESCs auf Matrigel ist CM-Medien mit 10ng/ml bFGF ergänzt alle 24 Stunden für bis zu 4-5 Tage gewechselt. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Dieses Video zeigt, wie die Passage hESCs von MEF Platten Feeder zellfreien Matrigel Platten. Beachten Sie, dass die Kolonie Dichte auf Matrigel höher als die Dichte der Kolonien, die von üblichen Aufteilung auf MEFs ist. Immunfluoreszenzfärbung und Mikroskopie oder Durchflusszytometrie für hESC Pluripotenz Marker, wie Oct-4 und SSEA-4, sind nötig, um Wartung von Zellkulturen in einem undifferenzierten Zustand in Feeder-freien Kulturbedingungen zu bestätigen.

<table><tbody><tr><td>Knockout-Serumersatz (KSR)</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagenz</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagenz</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagenz</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagenz</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4-Antikörper</td><td>Reagenz</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyco&amp;#8211;rythrin-konjugiertes Maus-IgG3</td><td>Reagenz</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Antikaninchen-IgG</td><td>Reagenz</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

von mefs auf matrigel 2: splitting hescs aus mefs auf matrigel

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen, wie die Passage hESCs von MEF Platten Feeder zellfreien Matrigel Platten zu wachsen.

Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.

Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel

Dieses Video demonstriert, wie humane embryonale Stammzellen (hESCs) auf Feederzellen aus embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) kultiviert werden und wie hESCs von MEF ...

Um die Kultur humaner embryonaler Stammzellen aufrechtzuerhalten, muss das Kulturmedium alle 24 Stunden gewechselt werden. Dazu beginnen Sie mit einer Flasche mit embryonalen Stammzell-Medien, die bei vier Grad Celsius gelagert wird. Entnehmen Sie die benötigte Menge an Lösung, die gewöhnlich etwa 20 Milliliter pro sechs beträgt.Platte gut und geben Sie diese Menge in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Erwärmen Sie das Röhrchen mit Inhalt auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Sobald das Medium erwärmt ist, geben Sie den FGF, der bei vier Grad Celsius gelagert wurde, in einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Achten Sie darauf, den BFGF-Standard unmittelbar nach Gebrauch wieder bei vier Grad Celsius aufzubewahren.Stellen Sie sicher, dass das bFGF im Kulturmedium für humane amox Stammzellen gründlich gemischt ist. Entfernen Sie anschließend das gesamte Medium aus jedem Brunnen, wobei etwa 500 Mikroliter pro Brunnen verbleiben. Geben Sie danach drei Milliliter frisches Medium in jeden Brunnen einer sechs-Brunnen-Platte und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.Nachdem wir Ihnen gezeigt haben, wie man humane embryonale Stammzellen auf ONMs kultiviert, zeigen wir Ihnen nun, wie man sie auf Matrigel überträgt. Um humane embryonale Stammzellen, die auf ONMs gezüchtet wurden, auf Matrigel zu übertragen, beginnen wir mit einer konfluenten 6-Loch-Platte von Stammzellen auf Mes, die im Verhältnis eins zu zwei oder eins zu drei auf Matrigel geteilt werden können. 6-Loch-Platten.Dadurch erreicht man, dass die Zellen vier bis fünf Tage nach dem Aufspalten erneut konfluent werden. Wenn humane embryonale Stammzellen auf Matrigel aufgeteilt werden, verwenden Sie Meth-Konditionierungsmittel, um die Pluripotenz zu erhalten. Das meth-konditionierte Medium wird im Voraus hergestellt, indem täglich über einen Zeitraum von sieben Tagen das Medium gesammelt wird, das mit fünf Nanogramm pro Milliliter BFGF aus einer wachsenden Meth-Kultur ergänzt wurde. Embryonales Stammzellmedium dient zum Ersetzen des entfernten meth-konditionierten Mediums.Jeden Tag. Das Meth-konditionierte Medium sollte bis zu einem Monat lang verwendet werden, nachdem es gesammelt und eingefroren gelagert wurde. Am Tag vor der Teilung humaner embryonaler Stammzellen überführen wir Matrigel-Aliquote in EOR-Röhrchen von minus 20 Grad Celsius auf vier Grad, um sie über Nacht auftauen zu lassen.Ein Aliquot enth&auml;lt zwei Milligramm Matri-Gel, was der f&uuml;r eine sechswellige Platte ben&ouml;tigte Menge entspricht. Am Tag des Aufteilens nehmen Sie ein Gef&auml;&szlig; des aufgetauten Matri-Gels.Für jede 6-Loch-Platte mischen Sie jedes Gefäß mit sechs Milliliter kaltem D-M-E-M-F-12-Medium. Denken Sie daran, dies auf Eis zu lagern. Geben Sie ein Milliliter der Lösung in jedes Loch einer 6-Loch-Platte.Dann die Platte schwenken, um das Matrigel auf der Oberfläche zu verteilen, und die mit Matrigel beschichtete Platte mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, bevor die humanen embryonalen Stammzellen geteilt werden. Vor dem Teilen der humanen embryonalen Stammzellen die Stammzellen auf MES einmal mit einem XPBS pH 7,4 waschen. Anschließend je nach zu teilenden Vertiefungen je einen Milliliter warme Kollagenase IV mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter in jede Vertiefung geben und die Platte dann bei 37 Grad Celsius fünf bis zehn Minuten lang inkubieren.Nach der Inkubation ein Milliliter embryonalen Stammzellmediums ohne BFGF zu jedem Gut hinzufügen und mit einer Ein-Milliliter-Pipette die Stammzellen vom Probenträger abblasen. Sammeln Sie das gesamte Medium, das Zellklumpen und tote Mes enthält, in einem 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Die großen Zellklumpen fünf Minuten lang sedimentieren lassen, sodass sich die Stammzellklumpen am Boden des Röhrchens als Pellet absetzen, während die Mes in der Überstandflüssigkeit suspendiert bleiben.Wenn die Zellen sich anscheinend angesiedelt haben, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet aus embryonalen Stammzellen resuspendieren. Verwenden Sie dazu embryonale Stammzell-Medien ohne BFGF, und zentrifugieren Sie anschließend bei Raumtemperatur mit 200 × g für fünf Minuten. Während die Zellen zentrifugiert werden, können die Matrigel-Platten für das Ausplattieren der Stammzellen vorbereitet werden, indem die Platten mit D-M-E-M-F 12 bei Raumtemperatur mit je einem Milliliter pro Vertiefung gewaschen und 2,5 Milliliter konditioniertes Medium ergänzt durch 10 Nanogramm pro Milliliter hinzugefügt werden.bFGF pro Mulde nach der Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Volumen an meth-konditioniertem Medium, das mit 10 Nanogramm pro Milliliter bFGF ergänzt wurde. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals auf und ab, bis die Klumpen gleichmäßig und klein sind.Als Nächstes aliquotieren Sie die Suspension mit 0,5 Milliliter pro Vertiefung auf die Matrigel-Platte, um ein Endvolumen von drei Milliliter pro Vertiefung zu erreichen. Für Matrigel verwenden wir eine höhere Koloniedichte als bei der üblichen Aufteilung auf Matrizen, sobald die Zellen hinzugefügt wurden. Stellen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Um die humanen embryonalen Stammzellen in Matrigel-Meth-Condition zu halten, wird das Medium, das mit 10 Nanogramm pro Milliliter bFGF ergänzt ist, alle 24 Stunden für bis zu vier bis fünf Tage gewechselt.Menschliche embryonale Stammzellen sind nach der ersten Teilung auf Matrigel gewöhnlich mit Restmengen von MEFs verunreinigt; die zweite Teilung von Matrigel auf Matrigel entfernt alle Spuren von Futterzellen, die die Stammzellkultur kontaminieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin.

Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen.

Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs

Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Trotz anhaltender Bemühungen, um den Übergang Kulturen Feeder-freien Bedingungen, bleiben die Ableitung und Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) weitgehend abhängig von Co-Kulturen mit embryonalen Feeder (MEF). Hier zeigen wir eine neuartige Methode zur schnellen Beseitigung Zubringer vom hESC Kulturen vor den Experimenten.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Hier präsentieren wir Kulturprotokolle für humane pluripotente Stammzellen (hPSC), die auf dem Wachstum von dissoziierten Einzelzellen basieren. Diese neue Methode, bei der Rho-assoziierte Kinase-Inhibitoren oder die Laminin-Isoform 521 (LN-521) verwendet werden, eignet sich für die Herstellung großer Mengen homogener hPSCs, die genetische Manipulation und die Wirkstoffforschung.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Lernen Sie die Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) auf Matrigel ohne Fütterzellen. Diese Methode zeigt das kontinuierliche Passagieren und die Pluripotenzbestätigung mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.

Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel

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