Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Im Caldwell Lab, AKA, the Worm Shack, untersuchen wir neurologische Krankheitsmechanismen in der Meereseleganz. Und nach einem langen Tag voller fruchtbarer Experimente belohnen wir uns mit etwas Freizeitaktivität. Hallo, ich bin Adam Knight, Student am Calwell Laboratory am Department of Biological Sciences der University of Alabama.

Heute werden ich und andere zeigen, wie man einen Dopamin-Neuronen-Degenerations-Assay in C Elegants durchführt. Ich werde einen neurodegenerativen Dopamin-Wurmstamm mit transgenen Stämmen kreuzen, die krankheitsbezogene Gene und Dopamin-Neuronen überexprimieren. Hallo, ich bin Adam Harrington, ein Doktorand im Caldwell Lab.

Heute zeige ich Ihnen, wie Sie die transgenen Würmer für die Dopamin-Neuronenanalyse einrichten. Hallo, ich bin Shu Amichi und ich bin Doktorandin. Hier zeige ich Ihnen, wie Sie Ihre Dopamin-Neuronen von C-Eleganz, die Steinpilze und Helfer genannt werden, testen können.

Im Allgemeinen weisen die Würmer, die nur GFP in den Dopamin-Neuronen exprimieren, keinen Zelltod auf. In Gegenwart von CLE werden Sie jedoch diese und altersabhängige Neurodegeneration beobachten. Mit diesem Assay konnte ein Transgen in den Dopamin-Neuronen co-exprimiert werden, um zu bestimmen, ob es die CLE-induzierte Toxizität verstärken oder unterdrücken kann. Also lasst uns loslegen.

Bevor wir die Dopamin-Neuronen-Analyse durchführen, müssen wir zunächst die entsprechenden GaN-Stämme kreuzen, um acht Mills, die sowohl Alpha-Kern als auch GFP exprimieren, unter der Kontrolle des Dopamin-Neuronen-spezifischen Promotors dat one auf die Paarungsplatte zu setzen. Fügen Sie nun zwei vierstufige transgene Ca-Aphroditen hinzu, die eine Dopamin-Neuronen-spezifische Expression unseres Kandidatengens von Interesse aufweisen, sowie die Expression von Körperwandmuskelzellen des DS-roten und zwei fluoreszierenden selektierbaren Markers. Es ist wichtig zu beachten, dass wir für jedes transgene Konstrukt drei stabile transgene Linien erzeugen.

Diese genetische Kreuzung sollte also für jede der drei getrennten Stalllinien, die erstellt wurden, individuell durchgeführt werden. Nach zwei Tagen entfernen Sie die Männchen und entsorgen sie nach weiteren zwei bis drei Tagen. Überprüfen Sie die F1-Generation.

Es gibt mehrere männliche Nachkommen und die Verpaarung war erfolgreich. Als nächstes werden einzeln vier Tiere aus jeder Kreuzung auf neue Platten fünf von Aphrodite L übertragen, die sowohl den GFP-Fluoreszenzmarker aufweisen, der vom männlichen Elternteil geerbt wurde, als auch den DS-roten zwei fluoreszierenden Körperwandmuskelmarker, der vom Hamadi-Elternteil geerbt wurde. Die übertragenen Tiere müssen sich in der Stufe L vier befinden, um sicherzustellen, dass sie noch nicht M it haben.

Wenn die männlichen Tiere auf dem Teller vorhanden sind, lassen Sie die Tiere drei bis vier Tage lang sich selbst befruchten, um F-Zwei-Nachkommen zu produzieren. Reinige nun die F zwei Nachkommen, um dies zu tun. Übertragen Sie fünf bis 10 Tiere, die beide Cent-Marker aufweisen, auf ihre eigenen Teller

Untersuchen Sie dann die F-3-Generation auf Platten, in denen hundert Prozent der Tiere GFP in den Dopamin-Neuronen exprimieren und in denen einige der Tiere die roten DS-, zwei fluoreszierenden Marker- und Körperwandmuskelzellen exprimierten. Diese Tiere werden homozygot für das Alpha-Synuclein und die GFP-Gene sein und auch das neu geschaffene Transgen stabil übertragen. Sobald das Screening abgeschlossen ist, sind wir bereit, die dopaminerge Neuronenanalyse durchzuführen.

Um mit der Neuronenanalyse zu beginnen, bereiten Sie eine frische Platte mit den drei im vorherigen Schritt identifizierten F-Tieren vor. Richten Sie für jede der drei transgenen Linien eine Platte ein. Darüber hinaus ermöglicht die Platte, der Alpha-Synuclein-GFP-Stamm allein als Kontrolle, den Würmern das Wachstum bis zum Erwachsenenalter.

Sobald die Würmer das Erwachsenenalter erreicht haben, geben Sie 30 bis 40 transgene Tiere aus jeder Linie auf eine frische Platte. Lassen Sie sie fünf Stunden lang bei 20 Grad Celsius Eier legen. Nach fünf Stunden herausnehmen und entsorgen.

Die erwachsenen Tiere lassen die Embryonen drei bis vier Tage lang bei 20 Grad Celsius wachsen, bis sie das L-Vier-Stadium erreichen. Als nächstes werden etwa hundert transgene L 4-Tiere auf eine Platte mit 0,04 Milligramm pro Milliliter fünf Fluor gepflückt. Zwei Desoxy-Uridin.

Dieses Nukleotidanalogon verhindert die Entwicklung der nächsten Generation durch Hemmung der DNA-Synthese. Da die FDUR-Platten lichtempfindlich sind, schützen Sie sie vor Licht, indem Sie die Platten verdeckt und vollständig umwickelt aufbewahren. Machen Sie ein grobes Pad für die Wurmanalyse.

Diese werden frisch verwendet und dürfen nicht austrocknen. Lege zwei Objektträger aus, die mit einem Stück Klebeband bedeckt sind. Längs. Das Band dient als Abstandshalter für gleich dicke Pads.

Lege eine dritte Rutsche dazwischen auf die Bank. Sie sind positioniert. Drei nebeneinander.

Geben Sie einen Tropfen geschmolzenen Arus auf die Mittelseite und legen Sie schnell eine weitere Folie senkrecht auf die Agros senkrecht zwei und über alle drei Rutschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um mehrere zusätzliche Pads so zu erstellen, wie für die Anzahl der zu analysierenden Proben erforderlich sind. Sobald die Schneckenpads fertig sind, geben Sie einen sechs Mikroliter großen Tropfen von drei Millimolaren, einer 11-Meilen-Säge und einem Betäubungsmittel auf ein 22 x 30 Millimeter großes Deckglas.

Nehmen Sie 40 erwachsene Tiere in den Tropfen und drehen Sie dann das Deckglas auf das Agros-Pad. Wiederholen Sie den Vorgang für jede der anderen Zeilen. Bewerten Sie 30 Tiere pro Linie für das Vorhandensein jedes CEP und eines D-Neurons.

Unter Verwendung eines Verbundmikroskops mit Epi-Fluoreszenz in einem Filterwürfel, der die Visualisierung von FITC oder GFP ermöglicht, verwenden wir einen Endo-G-F-P-H-Y-Q-Filterwürfel, um Daten auf einem Bewertungsbogen aufzuzeichnen. Wildtyp-Tiere behalten die vollständige GFP für den Unterricht in allen vier CEP-Neuronen und zwei A-DE-Neuronen bei. Einzelne Tiere, die einen Verlust von D-Neuronen aufweisen, werden als bekannter Wildtyp oder degeneriert eingestuft.

Diese Neuronen werden als LG oder Verlust von GFP aufgezeichnet. Ebenso kann das Ausmaß der Degeneration bewertet werden, indem die Gesamtzahl der in jedem Tier verlorenen Neuronen gezählt wird, und die Population wiederholt die Analyse zwei weitere Male. Verwendung von 30 weiteren Tieren pro Linie und Versuch.

Die Gesamtzahl der Würmer, die Wildtyp-Dopamin-Neuronen aufweisen, aus den drei Analyserunden wird gemittelt. Die statistische Analyse der Neuroprotektion wird dann mit dem T-Test P-Wert des Schülers von weniger als 0,05 durchgeführt. Um Kontrollwürmer mit Stämmen zu vergleichen, die Kandidatengene in Dopamin-Neuronen überexprimieren, führt diese Analyse verschiedene Tage nach der Eigasse durch, wobei die entsprechenden Analysetage empirisch bestimmt werden.

Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass 77 %, 87 % und 90 % der Alpha-CLE- und GFP-Tiere am sechsten, siebten bzw. zehnten Tag nach der Entwicklung degenerierte Dopamin-Neuronen aufweisen. Wenn wir also vorhersagen, dass das Transgen von Interesse die Neurodegeneration verstärken könnte, werden wir am sechsten Tag analysieren. Ebenso wird das Transgen, das die Neurodegeneration unterdrücken könnte, an den Tagen sieben und 10 analysiert.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie einen Dopamin-Neurodegenerations-Assay in Sea Elegance durchführen können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass bei genetischen Kreuzungen ein geeigneter Marker für die Selektion verwendet wird. Zweitens, verwenden Sie gesunde Rüden und L vier HEDIS für die Kreuzungen.

Und drittens: Stellen Sie sicher, dass Sie CEP und a DE-Neuronen sorgfältig und konsistent bewerten. Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, schnell auf genetische Faktoren zu testen, die die Alpha-Alpha-CLE-induzierte Neurodegeneration verstärken oder unterdrücken können. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.