Paradigmen für pharmakologische Charakterisierung von C. elegans Synaptic Transmission Mutanten

Hallo, ich bin Cody Locke vom Caldwell Laboratory im Department of Biological Sciences an der University of Alabama. Ich bin Kyle Lee und zeige Ihnen, wie Sie Würmer für Outta-Carb- und PTZ-Expositionstests vorbereiten. Ich bin Bernard Tu und zeige Ihnen, wie Sie Kohlenhydrattests durchführen können.

Ich bin Kaylin Berry und ich bin verantwortlich für die sea Elegance Videos. In dieser Präsentation werde ich diese Präsentation erzählen und den PTZ-Expositionsassay demonstrieren. Heute werden meine Kollegen und ich zeigen, wie synaptische Transmissionsmutanten mit einem Sea-Elegance-Modell der Epilepsie nach Exposition gegenüber PTZ und Alde-Carb mit einer Reihe repräsentativer Mutantenstämme charakterisiert werden können.

Also lasst uns loslegen. Kyle Lee wird uns heute zunächst die Vorbereitung von ALD-Carb-Assays am ersten Tag des Eingriffs zeigen. Stellen Sie sicher, dass am zweiten Tag mindestens 30 junge adulte Würmer jedes Genotyps und jedes Replikats für ALD-Kohlenhydrattests zur Verfügung stehen.

Es ist am besten, wenn ein Experimentator 50 oder mehr Liter vierstufige Würmer auf frische, fungizidfreie NGM-Platten auswählt, auf denen e coli OP 50 als Nahrungsquelle sitzt. Züchte die Würmer 12 bis 24 Stunden lang bei einer konstanten und freizügigen Temperatur. 20 Grad Celsius bis 22 Grad Celsius sind am besten, obwohl 25 Grad Celsius akzeptabel sind.

Am zweiten Tag stellen Sie eine 100 millimolare Stammlösung aus Al-Decarboxyl und 70 % Ethanol her und verteilen Sie die entsprechende Menge Al-Decarboxyl auf NGM-Platten. Wir verwenden konsequent 0,5 Millimolar al Decarb, indem wir 37,5 Mikroliter 100 Millimolar Alde Carb auf 60 Millimeter nicht belüftete Petriplatten mit 7,5 Millilitern in g plattieren. Lass die Alde-Vergaserplatten etwa 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.

Es ist nicht notwendig, die Deckel nach dem Trocknen der Platten zu knacken. Geben Sie gleichmäßige Mengen an E-coli in die Mitte jeder Alde-Kohlenhydratplatte und trocknen Sie sie weitere 30 bis 60 Minuten lang. Bei Raumtemperatur fügen wir typischerweise 25 Mikroliter e coli OP 50 hinzu.

Dieses Volumen von OP 50 schafft einen ausreichend großen Futterrasen, um die Würmer an einer kleinen Stelle in der Mitte des Tellers zu halten, ohne zu überfüllen. Sobald der Rasen trocken ist, fahren Sie mit Alba-Carb-Assays fort. Aufgrund der subjektiven Natur von ALD-Carb-Assays wird dringend empfohlen, Experimente blind durchzuführen.

Um dies zu tun. Ein Kollege des primären Experimentators beschriftet die Originalplatten mit den zu testenden Würmern neu, oder der Kollege könnte Würmer von den Originalplatten unmittelbar vor dem Starten eines Timers auf Alde-Vergaserplatten übertragen. Nachdem die Platten nun sortiert wurden, fährt Bor-ABO mit der Analyse fort, um mit der Analyse zu beginnen, und zählt die Anzahl der gelähmten Würmer.

Es gibt zwei Hauptansätze zur Definition der akuten al-Decarboxyl-induzierten Lähmung. Der erste Ansatz definiert die Lähmung durch Beendigung des Rachenpumpens. In diesem Video ist eine dunkle Struktur zu sehen, die sich im Lumen des Wurmrachens auf der rechten Seite des Bildschirms befindet.

Diese Struktur wird als Mühle bezeichnet und zieht sich durch einen cholinergen Mechanismus rhythmisch zusammen. Die Fortbewegung des Wurms in diesem Video wurde durch die Exposition von Al Decarb stark verlangsamt. Doch der Rachenschleifer dieses Wurms bewegt sich immer noch deutlich.

Daher wird dieser Wurm durch eine Einstellung der Pumpdefinition nicht gelähmt. In diesem Video sollte man sehen, dass sich der Rachenschleifer, der sich auf der rechten Seite des Bildschirms befindet, nicht mit Beendigung des Pumpens zusammenzieht, wie es die Arbeitsdefinition für al Decarb-induzierte Lähmungen ist. Dieser Wurm sollte als gelähmt eingestuft werden.

Wie der Wurm im vorherigen Video zeigt dieser Wurm jedoch leichte Seitwärtsbewegungen bei der Nahrungssuche. Obwohl die Fortbewegung durch Al Decarb beeinträchtigt ist, würden diese Bewegungen einen Experimentator daran hindern, diesen Wurm durch den zweiten Ansatz zur Definition von al Decarb-induzierter Lähmung, Ganzkörperunbeweglichkeit und Unempfindlichkeit gegenüber Berührungen als gelähmt zu betrachten. Der zweite Ansatz zur Definition der al-Decarboxyl-induzierten Lähmung besteht darin, jeden Wurm konsequent mit einem Platindraht anzustoßen und auf eine Reaktion zu prüfen.

Wenn Körperbewegungen mit bloßem Auge nicht erkannt werden können, ist unser bevorzugter Ansatz, unsere Würmer alle 30 Minuten alle 30 Minuten für insgesamt drei Stunden zweimal am Kopf und zweimal am Schwanz zu stoßen. Wie Sie sehen sollten, bewegt der Wurm in diesem Video nicht offensichtlich seinen Körper. Da dieser Wurm jedoch auf Anstöße mit einer deutlichen Bewegung seines Schwanzes reagiert, bezeichnen wir ihn nicht als gelähmt.

Durch die zweite Definition von al decarboxylinduzierte Lähmung. Wie der Wurm im vorherigen Video bewegt auch dieser Wurm seinen Körper nicht offensichtlich und erfordert daher einen Anstoßtest. Doch im Gegensatz zu dem Wurm im vorherigen Video reagiert dieser Wurm nicht eindeutig auf Anstöße.

Daher ist dieser Wurm durch die zweite Definition der al-Decarb-induzierten Lähmung gelähmt. Obwohl der Unterschied zwischen gelähmt und nicht durch Alde-Kohlenhydrate gelähmt sein kann, sollten Experimentatoren in der Lage sein, wesentliche Veränderungen und synaptische Übertragung zu identifizieren, indem sie einfach eine große Anzahl repräsentativer Würmer beobachten, die unmittelbar nach dem Aufgreifen auf Al-Decarb-Platten Al-Decarb ausgesetzt sind. Wildtyp-Würmer sind noch mobil.

In diesem Video. Man sieht die gleichen Wildtyp-Würmer aus dem vorherigen Video nach einer Stunde Al Decarb-Exposition. Beachten Sie, dass sich die Würmer bis zu einem gewissen Grad verlangsamen, sich aber immer noch deutlich bewegen.

Im Gegensatz zu Wildtyp-Würmern sind die Tomasin-One-Mutanten in diesem Video nach einer Stunde Exposition entweder vollständig immobilisiert oder bewegen sich kaum. Dieses Ergebnis stimmt mit Tomasin-1-Mutanten überein, die eine übermäßige Acetylcholinsekretion aufweisen, die auf die Unfähigkeit zurückzuführen ist, die Neurotransmitterfreisetzung an neuromuskulären Verbindungen negativ zu regulieren, das überschüssige Acetylcholin und die synaptischen Spalten an neuromuskulären Verbindungen in Kombination mit einer Hemmung des Acetylcholinabbaus, Bial Decarb macht Tomasin-1-Mutanten überempfindlich, obwohl hier nicht gezeigt, ähnliche Ergebnisse wurden postuliert, die sich aus ALDE-Carb-Assays mit Funktionsverlustallelen von auf 43 ergeben. die den C elegance ortho log der Calcium cal Moulin abhängigen Proteinkinase zwei kodiert. Dieses Video zeigt 25 Mutanten, die einen Mangel an inhibitorischer GABAerger Übertragung aufweisen.

Nach einer Stunde Exposition gegenüber Alde-Carb zeigen diese Mutanten, ähnlich wie Tomasin One und M 43-Mutanten, signifikante alde-Carb-induzierte Beeinträchtigungen des Bewegungsapparates und scheinen stärker betroffen zu sein als Wildtyp-Würmer, die über einen identischen Zeitraum Al-Decarb ausgesetzt waren. Dieses Ergebnis stimmt mit M 25-Mutanten überein, die eine überstimulierte Körperwandmuskulatur aufwiesen, die auf eine Kombination aus al-Decarb-Exposition und reduzierter GABAerger Übertragung zurückzuführen war, was zu einem größeren exzitatorischen zu inhibitorischen Transmissionsverhältnis an den neuromuskulären Verbindungen von CL ELs und anschließender Lähmung führte. Da Tomasin jedoch eine auf 43 und auf 25 Mutanten zu diesem Zeitpunkt eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber Al Decarb aufweist.

Obwohl es unterschiedliche Ursachen für die Überstimulation der Körperwandmuskulatur gibt, konnte ein Experimentator den zugrunde liegenden Mechanismus für die Überempfindlichkeit nicht kennen, ohne zuerst die Identität der ursächlichen Mutationen zu kennen. Für dieses Video kehrten wir zu den gleichen Wildtyp-Würmern aus einem früheren Video zurück, nachdem wir drei Stunden lang al Decarb Exposition an diesem Endpunkt unseres ALD-Carb-Assays ausgesetzt waren, sollte deutlich zu sehen sein, dass diese Würmer, obwohl sie vom Wildtyp sind, entweder vollständig immobilisiert sind oder sich kaum bewegen. Diese Würmer ähneln nun phänotypisch den Mutanten TOM one und M 25, die eine Stunde nach der Alde-Carb-Exposition gezeigt wurden, vermutlich weil die exzitatorische cholinerge Übertragung im Gegensatz zu Wildtyp-Würmern ein vergleichbares Niveau erreicht hat. Synap Bren one-Mutanten bleiben auch nach dreistündiger Exposition gegenüber Alde-Carb beträchtlich mobil.

Dieses Ergebnis stimmt mit synaptiven Bren-one-Mutanten überein, die keine normale Neurotransmittersekretion aufweisen und eine geringere cholinerge Stimulation an ihren Körperwandmuskeln aufweisen als Holz-Wildtyp-Würmer, die zu diesem Zeitpunkt identische Mengen an Alde-Carb-Exposition aufweisen. Point on four-Mutanten, die spezifisch einen Mangel an cholinerger Übertragung aufweisen, sollten eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber Al-Decarb aufweisen wie synaptive Bren one-Mutanten. Umgekehrt bleiben die hypersensitiven Mutanten Tomasin one und O 25 gelähmt, ähnlich wie bei Wildtyp-Würmern.

Es ist erwähnenswert, dass einige Würmer, insbesondere solche, die gegen Al-Decarboxyl resistent sind, versuchen können, von der Platte zu kriechen. In diesem Fall kann der Experimentator eine gleichmäßige Menge Palmitinsäure ausbringen, eine physikalische Barriere für die Fortbewegung von Würmern. Um die Al-Decarboxyl-Platten herum verteilen wir 25 Mikroliter 10 Milligramm Palmitinsäure pro Milliliter Ethanol.

Damit ist das Paradigma der Al-Decarboxyl-Exposition abgeschlossen. Jetzt werde ich das Penta Lean Terazol-Expositionsparadigma demonstrieren. Kaylin Berry wird uns bei PTZ-Assays helfen.

Die Vorbereitung von Würmern für PTZ-Assays ist im Wesentlichen die gleiche wie die Vorbereitung von Würmern für Alde-Carb-Assays. Die einzigen signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Assays sind die folgenden. Als PTZ-Lösungsmittel verwenden wir DDH zwei O anstelle von 70%Ethanol.

Da wir häufig größere Mengen PTZ als ALDE-Vergaser auf der Platte haben, lassen wir die Platten mindestens eine Stunde trocknen, bevor wir OP 50 hinzufügen. Palmitinsäure kann auch mit PTZ verwendet werden. Außerdem ist es wichtig zu beachten, dass PTZ viel weniger stabil ist als Alde-Vergaser und bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden muss.

Zu Beginn der Analyse zählen Sie alle 30 Minuten die Anzahl der epileptischen Lichtkrampfwürmer, insgesamt eine Stunde lang. Es ist am besten, die Anzahl der Würmer mit verschiedenen Arten von Krämpfen in getrennten Kategorien zu bewerten, wie z. B. Ganzkörperkrämpfe, vordere Krämpfe, die wir als Kopf-Bobs-Kombination von vorderen Krämpfen mit Körperwandmuskellähmung bezeichnen, die wir tonisch-klonische oder Ganzkörperlähmung nennen, die wir tonisches Tonikum nennen. Anfallsähnliche Aktivität, wie sie beim Wurm auf der rechten Seite zu beobachten ist, folgt oft auf tonisch-klonische Krämpfe, wie sie beim Wurm auf der linken Tonika zu sehen sind.

Anfallsähnliche Aktivität könnte einfach aus Muskelermüdung nach wiederholten tonisch-klonischen Krämpfen resultieren. Unsere unveröffentlichten Daten deuten jedoch darauf hin, dass einige Würmer auf PTZ tonisierend werden können, ähnlich wie bei al-decarboxylinduzierten Lähmungen, ohne zuvor tonisch-klonisch gewesen zu sein. Hier zeigen wir eine repräsentative synaptische Transmission, mutierte Wurmkriechen in Abwesenheit von PTZA, GABA-Rezeptorantagonisten und gemeinsamem Anfallsinduktor in verschiedenen Tiermodellen von Anfällen und Epilepsie.

Beachten Sie, dass die Spitze oder Nase des Wurms bei der Nahrungssuche von einer Seite zur anderen schwingt. In diesem Video zeigen wir einen weiteren Wurm aus demselben synaptischen Übertragungsmutantenstamm, der im vorherigen Video verwendet wurde. Beachten Sie, dass dieser Wurm, der sich in Gegenwart von 2,5 Milligramm PTZ pro Milliliter Wasser befindet, seinen Kopf während der Nahrungssuche meist weiter von einer Seite zur anderen bewegt.

Gelegentlich unterbricht dieser Wurm jedoch die Nahrungssuche von einer Seite zur anderen und schiebt stattdessen wiederholt seinen Vorderreifen nach vorne. Schließlich sollte man einen Wurm sehen, der die gleiche Mutation trägt wie die Würmer in den beiden vorherigen Videos in Gegenwart von 10 Milligramm PTZ pro Milliliter Wasser. Beachten Sie, dass dieser Wurm die Nahrungssuche von Seite zu Seite abgenommen hat und seinen vorderen Wurm mit einer größeren Häufigkeit und Intensität nach vorne schiebt als mit der niedrigeren Konzentration von PTZ.

Diese Ergebnisse zeigen die Dosisabhängigkeit von PTZ, die wir bei allen PTZ-sensitiven synaptischen Transmissionsmutanten beobachten. Wichtig ist, dass die Exposition gegenüber PTZ nicht ausreicht, um epileptische Krämpfe bei Wildtyp-Würmern auszulösen. Ebenso haben wir PTZ-induzierte epileptische Krämpfe bei Würmern mit spezifischen Defiziten in der cholinergen Übertragung, wie z.B. bei vier, oder Würmern mit übermäßiger cholinerger Übertragung, wie z.B. Tomasin eins, versucht, aber nicht beobachtet.

Daher sollte es möglich sein, synaptische Transmissionsmutanten mit Alde-Carbresistenz entweder von Defiziten in der allgemeinen synaptischen Funktion oder von spezifischen Defiziten in der cholinergen Transmission basierend auf ihrer relativen Sensitivität gegenüber PTZ weiter zu charakterisieren. Vielleicht überraschend ist eine starke Verringerung der Funktion der ONC 25-Mutante, der bei C elegance keine nachweisbare GABA-Expression fehlt. Inhibitorische Motoneuronen zeigen keine spontanen epileptischen Lichtkrämpfe, wie in diesem Video zu sehen ist.

Eine ONC 25-Mutante auf 10 Milligramm PTZ pro Milliliter Wasser. Zeigt jedoch robuste tonisch-klonische Krämpfe, obwohl nicht anterior, gingen nur Krämpfe mit etwas Bewegung den ONC 25-assoziierten tonisch-klonischen Krämpfen voraus und ahmten die Krämpfe der Synap Bren ein-Mutanten nach. Daher sollte ein Experimentator nicht davon ausgehen, dass alle inhibitorischen GABA-Mutanten in Gegenwart von PTZ tonisch-klonische Krämpfe oder eng damit verbundene tonische anfallsähnliche Aktivität aufweisen, insbesondere unter Berücksichtigung der Wahrscheinlichkeit, hypomorphe mutierte Allele zu erhalten.

Nun haben wir eine Überempfindlichkeit gegen Alde-Carb und PTZ durch inhibitorische GABA-Mutanten nachgewiesen, aber nur eine Überempfindlichkeit gegen Alde-Carb und eine normale Empfindlichkeit gegenüber PTZ durch Mutanten, denen eine negative Regulation der cholinergen Übertragung fehlt. Man könnte sich fragen, wie UNC 43-Mutanten mit Funktionsverlust auf PTZ aussehen, da sie auch überempfindlich gegenüber Alda-Kohlenhydraten sind, wie unsere anderen synaptischen Übertragungsmutanten auf 43-Mutanten, die in Abwesenheit von PTZ keine offensichtlichen epileptischen Krämpfe zeigen, obwohl diese Mutanten seltene, nicht repetitive, aber immer noch spontane Ganzkörperkontraktionen haben, nachdem sie 43 10 Milligramm PTZ pro Milliliter Wasser ausgesetzt waren. Funktionsverlust Mutanten vorhandene, robuste, repetitive und dosisabhängige Ganzkörperkrämpfe. Zu diesem Zeitpunkt sind diese Ergebnisse mehrdeutig, scheinen aber darauf hinzudeuten, dass on 43 keine spezifische Rolle bei der inhibitorischen GABAergen Übertragung oder eine Rolle bei der nur negativen Regulation der Neurotransmitterfreisetzung spielen muss.

Im Nervensystem C elegance haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie man CL-elgan-Synapsen-Transmissionsmutanten mit komplementären neuralen Stimulanzien, Alde-Carb, einem Cholinesterase-Hemmer und einem PTZA-GABA-Rezeptor-Antagonisten charakterisiert. Wenn Sie einem komplementären pharmakologischen Paradigma folgen, denken Sie daran, dass der Grad der Empfindlichkeit gegenüber einem neuronalen Stimulans den Grad der Empfindlichkeit gegenüber dem anderen neuronalen Stimulans nicht vorhersagen kann. Die Verwendung von Alde-Carb-Assays sollte helfen, inhibitorische GABA-Mutanten, die Bob auf PTZ leiten, aber überempfindlich gegenüber Alde-Carb sind, von allgemeinen synaptischen Funktionsdefiziten zu unterscheiden. die Bob auch auf PTZ steuern, aber resistent gegen Alde-Vergaser sind. Darüber hinaus sollte man sich darüber im Klaren sein, dass inhibitorische GABA-Mutanten Bob auf PTZ leiten, während Würmer, denen eine negative Regulation der cholinergen Übertragung fehlt, auf PTZ als Wildtyp auftreten.

Daher könnte der PTZ-Assay auch zur Unterscheidung zwischen diesen Klassen von synaptischen Transmissionsmutanten eingesetzt werden, die beide überempfindlich gegenüber Alde-Carb sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein komplementärer Ansatz mit PTZ- und Alde-Carb-Assays es einem Experimentator ermöglichen sollte, C-elegante synaptische Transmissionsmutanten auf eine Weise zu charakterisieren, die mit keinem der beiden Medikamente allein unmöglich ist. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.