Paradigmen für pharmakologische Charakterisierung von C. elegans Synaptic Transmission Mutanten

Hallo, ich bin Cody Locke aus dem Caldwell-Labor der Abteilung für Biowissenschaften an der University of Alabama. Ich bin Kyle Lee und ich zeige Ihnen, wie man Würmer für Outta-Carb- und PTZ-Expositions-Assays vorbereitet. Ich bin Bernard Tu und ich werde Ihnen demonstrieren, wie man Outta-Carb-Assays durchführt.

Ich bin Kaylin Berry und verantwortlich für die C. elegans-Videos. In diesem Vortrag werde ich die Präsentation kommentieren und den PTZ-Expositions-Assay demonstrieren. Heute werden meine Kollegen und ich zeigen, wie man synaptische Übertragungsmutanten mittels eines C. elegans-Modells der Epilepsie nach Exposition gegenüber PTZ und Aldehydcarbamid mit einer Reihe repräsentativer Mutantenstämme charakterisiert.

Beginnen wir also. Kyle Lee wird uns heute starten, indem er die Vorbereitung der ALD-Carb-Assays am ersten Tag des Verfahrens zeigt. Stellen Sie sicher, dass am zweiten Tag für jeden Genotyp und jedes Replica mindestens 30 Würmer im jungen Erwachsenenstadium für die ALD-Carb-Assays verfügbar sind.

Es ist am besten, wenn ein Experimentator 50 oder mehr Würmer im L4-Stadium auf frische, fungizidfreie NGM-Platten mit E. coli OP50 als Nahrungsquelle überführt. Kultivieren Sie die Würmer 12 bis 24 Stunden bei einer konstanten und permissiven Temperatur. 20 bis 22 °C ist optimal, obwohl 25 °C akzeptabel ist.

Am zweiten Tag eine 100 Millimolar-Stammlösung von Al Decarb und 70 % Ethanol herstellen und die geeignete Menge Al Decarb auf NGM-Platten auftragen. Wir verwenden konsequent 0,5 Millimolar Al Decarb, indem wir 37,5 Mikroliter einer 100 Millimolar-Alde-carb-Lösung auf 60 Millimeter große nicht belüftete Petrischalen mit 7,5 Milliliter in gm auftragen. Die Alde-carb-Platten etwa 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.

Es ist nicht notwendig, die Deckel zu öffnen, nachdem die Platten trocken sind. Geben Sie konsistente Volumina von E. coli in die Mitte jeder Alde-Carb-Platte und lassen Sie sie weitere 30 bis 60 Minuten trocknen. Bei Raumtemperatur geben wir typischerweise 25 µL E. coli OP50 hinzu.

Dieses Volumen von OP 50 erzeugt einen ausreichend großen Nährboden, um die Würmer auf einer kleinen Stelle in der Mitte der Platte zu halten, ohne dass es zu einer Überbevölkerung kommt. Sobald der Nährboden trocken ist, fahren Sie mit den alba carb-Assays fort. Aufgrund der subjektiven Natur der ALD-carb-Assays wird dringend empfohlen, die Experimente verblindet durchzuführen.

Dazu ein Kollege des Hauptexperimentators die ursprünglichen Platten mit den zu testenden Würmern neu beschriften oder die Würmer von den ursprünglichen Platten unmittelbar vor dem Starten einer Stoppuhr auf cipher alde carb Platten übertragen. Nachdem die Platten sied boron ABO wurden, wird mit der Analyse fortgefahren, indem die Anzahl der gelähmten Würmer gezählt wird.

Es gibt zwei wesentliche Ansätze, um die akute Al-Decarb-induzierte Lähmung zu definieren. Der erste Ansatz definiert Lähmung durch das Erliegen des pharyngealen Pumpens. In dieser Videoaufzeichnung ist eine dunkle Struktur zu sehen, die sich innerhalb des Lumens des Wurmpharynx rechts auf dem Bildschirm befindet.

Diese Struktur wird Mahlzahn genannt und kontrahiert sich über einen cholinergen Mechanismus rhythmisch. Die Fortbewegung des Wurms in diesem Video wurde durch Al-Decarb-Belastung stark verlangsamt. Dennoch bewegt sich der pharyngeale Mahlzahn dieses Wurms deutlich sichtbar.

Daher ist dieser Wurm aufgrund der Definition „Paralyse durch Pumpaufhören“ nicht paralysiert. In diesem Video sollte man erkennen, dass die pharyngeale Mahlmühle, die sich rechts auf dem Bildschirm befindet, nicht kontrahiert, was dem Pumpaufhören gemäß der geltenden Definition für eine durch al-Decarb induzierte Paralyse entspricht. Dieser Wurm sollte als paralysiert gewertet werden.

Jedoch zeigt dieser Wurm, ähnlich wie der Wurm im vorherigen Video, leichte seitliche Nahrungssuchbewegungen. Obwohl seine Fortbewegung durch Al Decarb beeinträchtigt ist, würden diese Bewegungen verhindern, dass ein Experimentator diesen Wurm gemäß der zweiten Definition von Al-Decarb-induzierter Lähmung – vollständiger Körperstarre und Unempfindlichkeit gegenüber Berührung – als gelähmt einstuft. Bei der zweiten Methode zur Definition der Al-Decarb-induzierten Lähmung wird jeder Wurm systematisch mit einem Platindraht angestupst und auf eine Reaktion überprüft.

Wenn Körperbewegungen mit bloßem Auge nicht erkannt werden können, ist unsere bevorzugte Vorgehensweise, unsere Würmer alle 30 Minuten insgesamt drei Stunden lang zweimal am Kopf und zweimal am Schwanz anzustupsen. Wie Sie sehen werden, bewegt der Wurm in diesem Video seinen Körper nicht offensichtlich. Dennoch betrachten wir diesen Wurm nicht als gelähmt, da er auf das Antippen reagiert, indem er seinen Schwanz deutlich bewegt.

Nach der zweiten Definition liegt eine Al-DeCarb-induzierte Lähmung vor. Wie der Wurm im vorherigen Video bewegt auch dieser Wurm seinen Körper nicht offensichtlich und erfordert daher einen Stimulationstest. Im Gegensatz zum Wurm im vorherigen Video reagiert dieser Wurm jedoch nicht eindeutig auf die Stimulation.

Daher ist dieser Wurm gemäß der zweiten Definition der Al-Dephosphorylierungs-induzierten Lähmung gelähmt. Obwohl der Unterschied zwischen gelähmten und nicht gelähmten Würmern durch Aldehyd-Dephosphorylierung subtil sein kann, sollten Experimentatoren in der Lage sein, signifikante Veränderungen der synaptischen Übertragung zu erkennen, indem sie einfach eine große Anzahl repräsentativer Würmer beobachten, die unmittelbar nach dem Umpflanzen auf Al-Dephosphorylierungs-Platten damit in Kontakt gekommen sind. Wildtyp-Würmer sind weiterhin beweglich.

In diesem Video sieht man die gleichen Wildtyp-Würmer aus dem vorherigen Video nach einer Stunde Al-Decarb-Behandlung. Beachten Sie, dass sich die Würmer etwas verlangsamt bewegen, aber dennoch deutlich in Bewegung sind.

Im Gegensatz zu Wildtyp-Würmern sind die Tomasin-eins-Mutanten in diesem Video nach einer Stunde Exposition entweder vollständig immobilisiert oder bewegen sich kaum noch. Dieses Ergebnis stimmt damit überein, dass Tomasin-eins-Mutanten aufgrund der Unfähigkeit, die Freisetzung von Neurotransmittern an neuromuskulären Synapsen negativ zu regulieren, einen übermäßigen Acetylcholin-Ausstoß aufweisen. Der Überschuss an Acetylcholin in den synaptischen Spalten an neuromuskulären Verbindungen, kombiniert mit einer Hemmung des Acetylcholin-Abbaus, macht Tomasin-eins-Mutanten hyperempfindlich gegenüber Bial Decarb. Obwohl hier nicht gezeigt, wurden ähnliche Ergebnisse für Alde Carb-Assays postuliert, bei denen Funktionsverlust-Allele von on 43 beteiligt sind, das das C. elegans-Ortholog des kalzium- und Calmodulin-abhängigen Proteinkinase 2 codiert. Dieses Video zeigt on 25-Mutanten, die in der inhibitorischen GABAergen Transmission defizient sind.

Nach einer Stunde Exposition gegenüber Aldecarb zeigen diese Mutanten, ähnlich wie die Tomasin-1- und M-43-Mutanten, signifikante, durch Aldecarb induzierte Bewegungsstörungen und scheinen stärker betroffen zu sein als Wildtyp-Würmer, die für eine identische Zeitspanne Aldecarb ausgesetzt waren. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die M-25-Mutanten eine Übererregung der Körperwandmuskulatur aufgrund einer Kombination aus Aldecarb-Exposition und verminderten GABAergen Übertragungen aufweisen, was zu einem erhöhten Verhältnis von exzitatorischer zu inhibitorischer Übertragung an den neuromuskulären Synapsen der CL-ELs und anschließender Lähmung führt. Da jedoch die Tomasin-1-43- und 25-Mutanten zu diesem Zeitpunkt eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber Aldecarb zeigen.

Trotz unterschiedlicher Ursachen für eine Überstimulation der Körperwandmuskulatur könnte ein Experimentator den zugrunde liegenden Mechanismus der Hypersensitivität nicht kennen, ohne zunächst die Identitäten der verursachenden Mutationen zu kennen. Für dieses Video kehrten wir nach drei Stunden Al-Decarb-Behandlung zu den gleichen Wildtyp-Würmern aus einem früheren Video zurück; an diesem Endpunkt unseres ALD-Carb-Assays sollte deutlich zu erkennen sein, dass diese Würmer, obwohl sie Wildtyp sind, entweder vollständig immobilisiert oder kaum noch beweglich sind. Diese Würmer sind nun phänotypisch ähnlich den TOM-eins- und M-25-Mutanten, die eine Stunde nach Aldecarb-Behandlung gezeigt wurden, vermutlich weil die exzitatorische cholinerge Transmission vergleichbare Niveaus erreicht hat. Im Gegensatz dazu bleiben Synap-Bren-eins-Mutanten nach drei Stunden Aldecarb-Behandlung deutlich beweglich.

Dieses Ergebnis stimmt mit Beobachtungen an Synaptive Bren one-Mutanten überein, die nach identischer Aldecarb-Behandlung zu diesem Zeitpunkt aufgrund verminderten Neurotransmitterfreisetzungsvermögens eine geringere cholinerge Stimulation ihrer Körperwandmuskulatur aufweisen als Wildtyp-Würmer. Point on four-Mutanten, die spezifisch in der cholinergen Transmission defizient sind, sollten eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber Aldecarb aufweisen wie Synaptive Bren one-Mutanten. Umgekehrt bleiben Tomasin one- und O 25-hypersensible Mutanten gelähmt, ähnlich wie Wildtyp-Würmer.

Es ist darauf hinzuweisen, dass einige Würmer, insbesondere solche, die gegen Al Decarb resistent sind, versuchen können, vom Objektträger wegzukriechen. In diesem Fall kann der Experimentator eine gleichmäßige Menge Palmitinsäure als physikalische Barriere gegen die Fortbewegung der Würmer auftragen. Um die Al-Decarb-Objektträger herum tragen wir 25 Mikroliter einer Lösung mit 10 Milligramm Palmitinsäure pro Milliliter Ethanol auf.

Das schließt das Al-Decarb-Expositionsparadigma ab. Nun werde ich das Penta-Lean-Terazol-Expositionsparadigma demonstrieren. Kaylin Berry wird uns bei den PTZ-Assays unterstützen.

Die Vorbereitung der Würmer für PTZ-Assays entspricht im Wesentlichen der Vorbereitung der Würmer für Aldecarb-Assays. Die einzigen wesentlichen Unterschiede zwischen den beiden Assays sind die folgenden. Wir verwenden DDH zwei O als PTZ-Lösungsmittel anstelle von 70 % Ethanol.

Außerdem, da wir häufig größere Volumina von PTZ im Vergleich zu ALDE carb auftragen, lassen wir die Platten mindestens eine Stunde lang trocknen, bevor wir OP 50 hinzufügen. Palmitinsäure kann ebenfalls mit PTZ verwendet werden. Außerdem ist es wichtig zu beachten, dass PTZ wesentlich instabiler ist als alde carb und bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden muss.

Um die Analyse zu beginnen, zählen Sie alle 30 Minuten die Anzahl der epileptischen, unter Licht krampfenden Würmer über einen Zeitraum von insgesamt einer Stunde. Es ist am besten, die Anzahl der Würmer mit verschiedenen Krampfarten in getrennten Kategorien zu erfassen, wie beispielsweise Vollkörperkrämpfe, vordere Krämpfe, die wir als Kopfnicken bezeichnen, eine Kombination aus vorderen Krämpfen mit Lähmung der Körperwandmuskulatur, die wir als tonisch-klonische oder Vollkörperlähmung bezeichnen, die wir als tonisch bezeichnen. Anfallsähnliche Aktivität, wie sie beim Wurm rechts zu sehen ist, folgt oft tonisch-klonischen Krämpfen, wie sie beim Wurm links im tonischen Stadium zu sehen sind.

Aktivität, die Anfällen ähnelt, könnte einfach auf Muskelermüdung nach wiederholten tonisch-klonischen Krämpfen zurückzuführen sein. Unsere unveröffentlichten Daten deuten jedoch darauf hin, dass einige Würmer unter PTZ tonisch werden können, ähnlich der durch al decarb induzierten Lähmung, ohne zuvor tonisch-klonische Krämpfe erlitten zu haben. Hier zeigen wir einen repräsentativen Synapsenübertragungs-Mutantenwurm, der in Abwesenheit von PTZ kriecht, einem GABA-Rezeptorantagonisten und häufig verwendeten Anfallsinduzierer in verschiedenen Tiermodellen von Anfällen und Epilepsie.

Beachten Sie, dass die Spitze oder Nase des Wurms beim Nahrungssuche von Seite zu Seite schwingt. In diesem Video zeigen wir einen weiteren Wurm desselben Mutantenstamms für synaptische Übertragung, der bereits im vorherigen Video verwendet wurde. Beachten Sie, dass dieser Wurm, der sich in Gegenwart von 2,5 Milligramm PTZ pro Milliliter Wasser befindet, beim Nahrungssuchen überwiegend weiterhin den Kopf von Seite zu Seite bewegt.

Doch dieser Wurm hält gelegentlich das seitliche Nahrungssuchen an und stößt stattdessen wiederholt sein Vorderende nach vorne. Schließlich sollte man einen Wurm beobachten, der dieselbe Mutation wie die Würmer in den beiden vorherigen Videos aufweist, jedoch in Gegenwart von 10 Milligramm PTZ pro Milliliter Wasser. Man beachte, dass dieser Wurm ein vermindertes seitliches Nahrungssuchen zeigt und sein Vorderende mit größerer Häufigkeit und Intensität nach vorne stößt als bei der niedrigeren Konzentration von PTZ.

Diese Ergebnisse zeigen eine Dosisabhängigkeit von PTZ, die wir bei allen PTZ-empfindlichen Synapsenübertragungsmutanten beobachten. Wichtig ist, dass die Exposition gegenüber PTZ nicht ausreicht, um epilepsieartige Krämpfe bei Wildtyp-Würmern hervorzurufen. Ebenso haben wir versucht, jedoch keine PTZ-induzierten epilepsieartigen Krämpfe bei Würmern mit spezifischen Defiziten in der cholinergen Übertragung wie on four oder bei Würmern mit übermäßiger cholinergen Übertragung wie tomasin one beobachtet.

Daher sollte es machbar sein, Synapsenübertragungs-Mutanten mit Alde-Carb-Resistenz hinsichtlich Defizite in der allgemeinen synaptischen Funktion oder spezifischer Defizite in der cholinergen Transmission weiter zu charakterisieren, basierend auf ihren relativen Empfindlichkeiten gegenüber PTZ. Vielleicht überraschenderweise zeigt ein starker Funktionsmangel-Mutant ONC 25, der keine nachweisbare GABA-Expression in C. elegans hemmenden Motoneuronen aufweist, keine spontanen epileptischen Lichtkrämpfe, wie sie in diesem Video zu sehen sind.

Ein ONC 25-Mutant in 10 Milligramm PTZ pro Milliliter Wasser zeigt jedoch robuste tonisch-klonische Krampfanfälle, obwohl keine vorderen alleinigen Krampfanfälle beobachtet wurden; vor den ONC 25-assoziierten tonisch-klonischen Krampfanfällen trat gelegentlich Bewegung auf, und die Krampfanfälle ahmten die von synap Bren one-Mutanten nach. Daher sollte ein Experimentator nicht annehmen, dass alle inhibitorischen GABA-Mutanten in Gegenwart von PTZ tonisch-klonische Krampfanfälle oder eng damit verbundene tonische, krampfartige Aktivität zeigen, zumal die Wahrscheinlichkeit besteht, hypomorphe Mutantenallele zu erhalten.

Nachdem wir nun eine Überempfindlichkeit gegenüber Alda carb und PTZ bei inhibitorischen GABA-Mutanten gezeigt haben, jedoch nur eine Überempfindlichkeit gegenüber Alda carb und eine normale Empfindlichkeit gegenüber PTZ bei Mutanten, denen die negative Regulation der cholinergen Transmission fehlt, könnte man sich fragen, wie UNC-43-Verlust-der-Funktion-Mutanten auf PTZ reagieren, da sie ebenfalls gegenüber Alda carb überempfindlich sind. Wie unsere anderen Mutanten der synaptischen Transmission zeigen auch 43-Mutanten ohne PTZ keine offensichtlichen, epilepsieartigen Krämpfe, obwohl diese Mutanten gelegentlich seltene, nicht repetitive, aber dennoch spontane Ganzkörperkontraktionen aufweisen. Nach Exposition gegenüber 10 Milligramm PTZ pro Milliliter Wasser zeigen 43-Verlust-der-Funktion-Mutanten jedoch starke, repetitive und dosisabhängige Ganzkörperkrämpfe. Derzeit sind diese Ergebnisse noch uneindeutig, deuten jedoch darauf hin, dass on 43 entweder keine spezifische Rolle in der inhibitorischen GABAergen Transmission spielt oder lediglich eine Funktion in der negativen Regulation der Neurotransmitterfreisetzung hat.

Im Nervensystem von C. elegans haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie man CL eglan Synapsenübertragungs-Mutanten mit komplementären neuronalen Stimulanzien charakterisiert: Aldecarb, einem Cholinesterase-Inhibitor, und PTZ, einem GABA-Rezeptorantagonisten. Wenn man entweder einem komplementären pharmakologischen Ansatz folgt, sollte man bedenken, dass der Grad der Empfindlichkeit gegenüber einem neuronalen Stimulans nicht den Grad der Empfindlichkeit gegenüber dem anderen neuronalen Stimulans vorhersagen kann. Die Verwendung von Aldecarb-Assays sollte helfen, hemmende GABA-Mutanten, die auf PTZ Kopfbewegungen (head bob) zeigen, aber gegenüber Aldecarb hypersensitiv sind, von Mutanten mit allgemein beeinträchtigter synaptischer Funktion zu unterscheiden, die ebenfalls auf PTZ Kopfbewegungen zeigen, aber gegenüber Aldecarb resistent sind. Darüber hinaus sollte man berücksichtigen, dass hemmende GABA-Mutanten auf PTZ Kopfbewegungen zeigen, während Würmer, denen die negative Regulation der cholinergen Transmission fehlt, auf PTZ wildtypisch erscheinen.

Daher könnte der PTZ-Test auch verwendet werden, um zwischen diesen Klassen von Synapsenübertragungs-Mutanten zu unterscheiden, die beide überempfindlich gegenüber Alde carb sind. Zusammenfassend sollte ein ergänzender Ansatz mit PTZ- und Alde-carb-Tests es einem Experimentator ermöglichen, C. elegans-Synapsenübertragungs-Mutanten auf eine Weise zu charakterisieren, die mit jeweils nur einer der beiden Substanzen nicht möglich ist. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.