Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Hallo, ich bin Randall Hoffman, Doktorand am Susan Linus Laboratory in der Biologieabteilung des MIT. Heute stelle ich Ihnen das halbdenaturierende Waschmittel Agro Rose, Gelelektrophorese oder SDD Age vor. Unser Labor verwendet diese Technik, um nach Prionen und anderen alogenen Proteinen zu suchen.

Unsere Version von SDD age ist einfach und zuverlässig und kann skaliert werden, um eine beliebige Anzahl von Proben aufzunehmen. Amyloide sind außergewöhnlich resistent gegen Denaturierung durch SDS, wodurch sie mit SDDH von anderen Proteinen getrennt werden können. Daten von SDDH allein können jedoch nicht verwendet werden, um zu bestätigen, dass etwas Amyloid ist.

Um dies zu tun, müssen Sie andere Techniken verwenden. In diesem Sinne möchte ich es Ihnen zeigen. S-D-D-H-S-D-D-H kann mit Standardgeräten für die horizontale DNA-Elektrophorese durchgeführt werden.

Zuerst müssen Sie die Gelgießschale zusammenbauen. Die Größe des Geräts hängt davon ab, wie viele Proben Sie haben. Für eine große Anzahl von Proben verwenden wir eine 20 x 24 Zentimeter große Platte und bis zu vier 50-Well-Kämme.

Um das Gel herzustellen, benötigen Sie eine mittlere oder hohe Gelstärke, niedrige Gelstärke, EEO agros, einen XTAE-Puffer und eine 10%ige Stammlösung aus SDS. Stellen Sie eine 1,5%ige AROS-Lösung und eine XTAE her. Sie sollten das Gel so dick wie möglich machen, damit Sie die meisten Proben laden und die Detektion maximieren können. Die Mischung in der Mikrowelle erhitzen, bis sich der Aros vollständig aufgelöst hat.

Den 100 XSDS-Vorrat schnell auf 0,1 % geben und zum Mischen schwenken. Wenn sich während dieses Schritts etwas Agro verfestigt, rot, lösen Sie es auf einer heißen Platte auf. Achte darauf, dass du es nicht kochen lässt.

Nachdem Sie SDS hinzugefügt haben, da die Lösung leicht übersprudelt, gießen Sie diese Lösung in die Gießschale, solange sie noch heiß ist. Verwenden Sie dann einen Kamm, um Blasen zu entfernen, die später während des Geltransfers stören könnten. Nachdem das Gel vollständig abgekühlt und fest geworden ist, entfernen Sie vorsichtig die Waben und geben Sie das Gel in den Tank.

Tauchen Sie das Gel vollständig in ein XTAE mit 0,1 % SDS. Sie können nun Ihre Proben laden. Die Proteinproben, die in SDDH verwendet werden, werden mit zwei wichtigen Ausnahmen wie auf einer SDB-Seite vorbereitet.

Erstens sollten Sie vermeiden, die Proben zu erhitzen, da dies die Aggregate zu Proteinmonomeren denaturieren könnte. Zweitens: Achten Sie darauf, den Proteinabbau zu vermeiden. Da die hier verwendeten denaturierenden Bedingungen nicht ausreichen, um alle Proteasen zu inaktivieren, empfehlen wir, mindestens die doppelte empfohlene Konzentration eines vollständigen Proteasehemmer-Cocktails zu verwenden.

In dieser Demonstration verwenden wir Lysate aus Hefezellen, die ein bestimmtes Protein von Interesse überexprimieren. Wir verwenden in der Regel zwei Mil über Nacht. Kulturen, die in 96 gezüchtet wurden, sind bei VWR erhältlich, aber bei der Analyse von Proteinen mit geringer Abundanz müssen größere Kulturvolumina verwendet werden.

Ernten Sie die Zellen, indem Sie die Kultur nach dem Zentrifugieren fünf Minuten lang bei 2000 RCF bei Raumtemperatur zentrifugieren, entfernen Sie das Supranatant und waschen Sie die Zellen mit Resus, suspendieren Sie es in Wasser und zentrifugieren Sie es nach dem zweiten Schleudern, entfernen Sie den Überstand und harzen Sie die Zellen in einer Ersatzplattierungslösung. Das zy in der Lösung verdaut die Zellwände, wodurch Sie die Zellen effizient und ein kleines Volumen an Lysepuffer reinigen können. 30 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Pelletieren Sie die überschüssigen Kunststoffzellen, diesmal bei 800 RCF für fünf Minuten. Entfernen Sie das Sat vollständig und resuspendieren Sie jedes Pellet und 100 Mikroliter Lysepuffer. Decken Sie dann den Block mit Klebeband ab und wirbeln Sie ihn zwei Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit auf.

Dies hilft allen Kugelkunststoffen, die zellulären Trümmer bei 4.000 RCF LY P auszuscheiden. Zwei Minuten lang. Übertragen Sie das S Natin vorsichtig auf eine 96-Well-PCR-Platte.

In der Regel analysieren wir in unserem Labor Hunderte von Proben gleichzeitig, daher steht uns dabei ein Liquid-Handling-System zur Seite. Bestimmen Sie auf Wunsch die Proteinkonzentration der Lysate. Als nächstes fügen Sie den Proben vier x Probenpuffer hinzu, um Lysate zu erzeugen, die einen x Probenpuffer enthalten, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Laden Sie nun die Proben in das Gel. Falls gewünscht, speichern Sie die Hälfte der Beispiele für die SDB-Seitenanalyse. Laden Sie auch Molekulargewichtsmarker, einschließlich vorgefärbter Marker und einen Marker mit sehr hohem Molekulargewicht, wie z. B. Hühnerflektorextrakt.

Falls gewünscht, ist es wichtig, das Gel kühl zu halten, um die Diffusion von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht zu verhindern, daher sollten Sie es im Kühlraum laufen lassen. Lassen Sie das Gel bei niedriger Spannung von weniger als drei Volt pro Zentimeter der Gellänge laufen. Lassen Sie das Gel mehrere Stunden lang laufen, bis die Ausdehnung etwa einen Zentimeter vom Ende des Gels entfernt ist.

Da Amyloid bei Raumtemperatur nicht durch 2 %SDS denaturiert wird, bleibt es intakt, während andere Komplexe, einschließlich der meisten Nicht-Amyloid-Aggregate, in Gegenwart von 2 %SDS dissoziieren. Daher sind die meisten Proteine monomer und laufen schnell durch das Gel. Während die SDS-resistenten Amyloide mit hohem Molekulargewicht langsamer wandern.

Danach ist das Gel bereit für den Transfer. Obwohl mehrere Transfermethoden verwendet werden können, erzielen wir die besten Ergebnisse mit dem Kapillartransfer. Da der Kapillartransfer jede beliebige Größe von Gel aufnehmen kann, ist es praktisch, Hunderte von Proben im Kapillartransfer zu analysieren.

Ein Stapel von Dry-Blotting-Papieren dient dazu, Puffer durch das Gel zu ziehen und Proteine auf eine Nitrozellulosemembran zu ziehen, die zwischen den Papieren und dem Gel platziert ist. Du musst ein Stück Nitrozellulose, z. B. High Bond C, extra auf die gleichen Abmessungen wie das Gel schneiden. Außerdem musst du 20 Stücke GBO oh vier und acht Stücke GBO oh two Löschpapier auf die gleiche Größe wie das Gel zuschneiden.

GB oh four ist sehr dickflüssig und saugfähig. Während GBO oh two viel dünner ist und eine feinere Textur hat, sorgt sie für einen gleichmäßigeren Kontakt mit der Membran. Schneiden Sie ein zusätzliches Stück GBO oh four ab, das als Docht verwendet werden soll, und machen Sie es etwa 20 Zentimeter breiter als das eingetauchte Gel.

Der Nitrous UL WIC und vier Stück GBO oh two und ein XTBS in einem Kunststoffbehälter fügen einen Stapel Papiere wie folgt zusammen, 20 Stück trockenes GBO oh vier. Dann vier Stücke trockenes GBO oh zwei. Dann ein Stück vorbenetztes GBO oh zwei.

Lege die Nitrozellulose auf diesen Stapel. Spülen Sie das Gel auf der Gießschale kurz in Wasser ab, um überschüssigen Laufpuffer zu entfernen. Beginnen Sie dann vorsichtig, das Gel vom Tablett auf den Stapel zu schieben, während Sie das Gel vom Tablett schieben und die Membran bei Bedarf mit TBS bestücken.

Der zusätzliche Puffer verhindert, dass Blasen im Gel eingeschlossen werden. Die Transferpipette eignet sich gut für diesen Zweck, nachdem das Gel vollständig auf den Stapel bewegt wurde. Überprüfen Sie gründlich, ob Blasen vorhanden sind.

Heben Sie den Rand des Gels an und tragen Sie den Puffer erneut auf, bis die Blasen herausgearbeitet werden können. Lege die restlichen drei vorbenetzten GBO oh zwei Stücke auf das Gel. Stellen Sie einen gründlichen Kontakt zwischen allen Schichten sicher, indem Sie eine Pipette fest über die Oberseite des Stapels rollen.

Flankieren Sie den Transferstapel mit zwei erhöhten Tabletts, die TBS enthalten, und drapieren Sie den vornassen Docht über den Stapel, so dass beide Enden des Dochts untergetaucht sind. Decken Sie bei TBS den zusammengebauten Transferstapel mit einer zusätzlichen Kunststoffschale ab, die zusätzliches Gewicht trägt, z. B. eine 500-mil-Flasche Wasser. Der Docht zieht einen Puffer aus den Schalen und die trockenen Löschpapiere ziehen den Puffer über mehrere Stunden durch das Gel.

Dadurch werden die Proteine auf der Membran abgelagert, so dass der Transfer für mindestens drei Stunden oder über Nacht stattfinden kann. Nachdem der Kapillartransfer abgeschlossen ist, kann die Membran durch Standard-Western-Blotting bearbeitet werden. Hier sehen Sie einen typischen Blot von Proteinen, die in einem Hefestamm überexprimiert wurden, der bestimmte Proteine zur Bildung von Amyloid prädisponiert.

Sie können deutlich sehen, dass einige unserer Kandidaten Amyloid- oder hochmolekulare SDS-resistente Spezies sehr gut bilden, wie die hier und hier gezeigten. Andere bilden jedoch keine Aggregate und sind vollständig monomer, wie diese und diese. Außerdem können Sie sehen, dass die Größe der Amyloid-Polymere je nach Protein unterschiedlich ist, was Sie in diesen beiden Bahnen sehen können.

Wir haben Ihnen gerade eine einfache Methode zur Analyse von hochmolekularen, unlöslichen Aggregaten, wie z. B. Amyloiden von Prionenkandidaten, gezeigt. Wir hoffen, dass Ihnen unsere Präsentation gefallen hat und Sie diese Technik und Studien über immunogene Proteine von Amy nützlich finden. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrer Recherche.