Name: Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Erfahren Sie die semi-denaturierende Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese (SDD-AGE) zur Charakterisierung amyloidartiger Polymere in Zellen. Diese skalierbare Methode ermöglicht Screening von Prionen und anderen aggregationsanfälligen Proteinen.

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Wir danken Simon Alberti für die Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM25874), ein Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (zum SL), und ein National Science Foundation Chemiefonds Ausbildungsförderung (RH) unterstützt.

<html> Teil 1: Vorbereiten des Gels <ol><li> Montieren Sie den Gelträger. Serienausstattung für horizontale DNA-Elektrophorese verwendet werden kann. Für eine große Anzahl von Proben, bereiten wir eine 20 cm x 24 cm Platte mit bis zu vier 50-gut Kämme. Sicherstellen, dass die Platte nicht Kratzer, da diese die blot Bild verzerren können. </li><li> Erstellen Sie ein 1,5% Agarose-Lösung (mittlere oder hohe Gel-Festigkeit, geringes EBO) in 1X TAE. Das Volumen sollte ausreichen, um komplett versenken die Kammzähne - Sie wollen so viel wie möglich zu laden Probe den Nachweis zu maximieren. Microwave die Mischung, bis die Agarose vollständig gelöst ist. </li><li> Schnell add SDS zu 0,1% aus einer 10% Aktien. Swirl zu mischen. Wenn einige Agarose erstarrt bei diesem Schritt wieder auflösen mit einer heißen Platte und vorsichtig sein, um zu vermeiden Kochen. </li><li> Füllen Sie die Lösung in die Casting-Fach. Verwenden Sie einen Kamm zu harken jegliche Blasen, wie sie später mit Transfer stören könnten. </li><li> Nach gel gesetzt hat, entfernen Sie Kämme und Stelle das Gel in das Gel Tank. Ganz untertauchen das Gel in 1X TAE mit 0,1% SDS. </li></ol> Teil 2: Probenvorbereitung <ol><li> Für Hochdurchsatz-Analyse von Hefe-Lysaten, beginnen wir mit 2-ml-Kulturen über Nacht unter schnellem Rühren in 96-Well-Blocks gewachsen. In diesem Fall wird jede Kultur Überexpression eines Proteins von Interesse. Bei der Analyse geringer Menge Proteine, müssen größere Kultur-Volumes verwendet werden </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2000 RCF für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Die Zellen in Wasser und Zentrifuge wieder. </li><li> Resuspendieren in 1 ml Spheroplasting Lösung. Inkubieren für ca. 30 min bei 30 ° C (Sie können Spheroplasting Effizienz durch Mikroskopie bestätigt). </li><li> Zentrifuge bei 800 RCF für 5 min bei Raumtemperatur. Vollständig zu entfernen Überstand. </li><li> Resuspendieren pelletiert Sphäroplasten in 100 ml Lysepuffer. </li><li> Bedecken Sie den Block mit Klebeband und Wirbel bei hoher Geschwindigkeit für 2 min. </li><li> Pellet Zelltrümmer bei 4000 RCF für 2 min. </li><li> Sorgfältig Überstand zu entfernen, um einen neuen Container, z. B. eine 96-well PCR-Platte. </li><li> Wenn gewünscht, Bestimmung der Proteinkonzentration der Lysate. </li><li> Add 4X Probenpuffer, um die Proben zu Lysaten mit 1x Probenpuffer zu generieren. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Last-Gel. Falls gewünscht, speichern Sie die Hälfte des Probenvolumens und kochen sie für die SDS-PAGE-Analyse. Um das Ausmaß der Übertragung später auf dem Monitor, eine pre-gefärbten SDS-PAGE-Marker. Darüber hinaus kann ein Molekulargewichtsmarker, bestehend aus sehr großen Proteine ​​(zB Huhn pectoralis-Extrakt) verwendet, um Größen von der beschlossenen Komplexe zu schätzen. </li><li> Run bei niedriger Spannung (≤ 3 V / cm Gel Länge) bis der Farbstoff vor Erreichen ~ 1 cm vom Ende des Gels. Dies wird mehrere Stunden dauern. Es ist wichtig, dass das Gel kühl bleiben, sonst Diffusion von niedermolekularen Proteins (z. B. Monomere) können ihre Nachweisgrenze. </li></ol> Teil 3: Transfer <ol><li> Schneiden Sie ein Stück Nitrozellulose, um die gleichen Abmessungen wie das Gel. </li><li> Cut 20 Stück GB004 und GB002 8 Stück Löschpapier, auf die gleichen Abmessungen wie das Gel. Cut ein zusätzliches Stück GB004 als Docht verwendet werden; es etwa 20 Zentimeter breiter als das Gel. </li><li> Tauchen Sie die Nitrozellulose, Docht und 4 Stück GB002 in 1X TBS. </li><li> In einem Kunststoff-Behälter, montieren Sie einen Stapel von Papieren wie folgt: 20 Stück trockenen GB004, dann 4 Stück trockenes GB002, dann ein Stück vor nassen GB002. Legen Sie die Nitrozellulose auf dieses Stacks. </li><li> Spülen Sie das Gel auf die Gelträger kurz in Wasser, um überschüssiges Laufpuffer zu entfernen. Dann vorsichtig beginnen, um das Gel vor der Tablettrutsche auf den Stapel. Während Sie das Gel aus dem Fach, begießen die Membran mit TBS wie nötig. Die zusätzlichen Puffer verhindert, dass Luftblasen aus Einklemmen unter dem Gel. Ein Transferpipette eignet sich gut für diesen Zweck. </li><li> Nachdem das Gel wurde auf den Stapel verschoben worden ist, sorgfältig überprüfen, ob Luftblasen. Falls vorhanden sind, heben Sie den Rand des Gels und erneut Puffer, bis die Blasen ausgearbeitet werden kann. </li><li> Legen Sie die restlichen drei vorbefeuchtet GB002 Stücke auf dem Gel. Auf gute Kontakt zwischen allen Schichten durch Walzen einer Pipette fest an der Oberseite des Stapels. </li><li> Flank die Übertragung Stack mit zwei erhöhten die Fächer mit TBS. Hängen Sie die Pre-wet Docht über den Stack, so dass jedem Ende der Docht in TBS getaucht ist. </li><li> Decken Sie die versammelten Transfer-Stack mit einem zusätzlichen Kunststoff-Tablett, auf dem Zusatzgewicht (zB eine 500 ml Flasche Wasser). </li><li> Lassen Sie den Transfer für ein Minimum von drei Stunden oder über Nacht gehen. </li><li> Nach der Übertragung kann die Membran durch Standard-Western-Blot-verarbeitet werden. </li></ol> Spheroplasting Lösung 1,2 M D-Sorbit 0,5 mM MgCl 2 20 mM Tris, pH 7,5 50 mM BME (add frisch) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (add frisch) coration: underline; &quot;&gt; Lysispuffer 100 mM Tris 7,5 50 mM NaCl 10 mM BME (add frisch) Protease-Inhibitoren (add frisch) 4X Sample Buffer 2X TAE 20% Glycerin 8% SDS Bromphenolblau den Vorzug

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-AGE wurde zuerst von Kryndushkin et al. 1, zu SDS-resistenten Komplexen des Studiums der [PSI +] Prion in Hefe, und hat seitdem große Verbreitung gefunden Studium sowohl Prion-und Nicht-Prion-Aggregate 2-9. Allerdings ist die Übertragung der Proteine ​​auf eine Membran nach Elektrophorese in einem Agarosegel problematisch und kann zu einem verzerrten Bild 5 blot Ergebnis. Darüber hinaus führt die versunkene Elektroblotting Technik am häufigsten verwendeten praktischen Grenzen für die Größe des Gels und damit die Anzahl der Proben, die verarbeitet werden können. Wir haben diese Probleme durch den Einsatz von nach unten Kapillartransfer 10, ein einfaches Verfahren, das einen Stapel von Dry-Blotting Papiere benutzt, um Proteine ​​aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen gerichtet. Kapillar-Transfer verhindert Verzerrungen und ermöglicht große Gele auf einfache Weise bearbeitet werden. Es gibt ein paar Dinge, die vor über SDD-AGE zu betrachten. Für Rohöl Proben (zB Lysate), wird durch immunologischen Nachweis spezifischer Proteine ​​notwendig. SDD-AGE nicht vollständig denaturiert das Protein-Komplexe von Interesse, so das Protein (s) nachgewiesen werden muss ein Epitop-Tag außerhalb der amyloidogene Region zu tragen. Lysate können in der Regel hergestellt, wie sie für eine normale SDS-PAGE werden würde, mit zwei wichtigen Unterschieden. Zunächst muss darauf geachtet werden, erhöht den Abbau durch Proteolyse zu verhindern. Die teilweise denaturierenden Bedingungen werden dabei nicht ausreichend, um Proteasen zu inaktivieren, und kann auch Zielproteine ​​anfälliger für Proteolyse. Verwenden Sie eine komplette Protease-Inhibitor-Cocktail an mindestens zwei-fache der empfohlenen Konzentration. Zweitens Erwärmung der Proben sollte vermieden werden. Wenn ein all-Monomer negative Kontrolle ist erwünscht, um beispielsweise sicherzustellen, dass hohe Molekulargewicht Arten nicht durch kovalente Modifikationen, eine 10-minütige Inkubation bei 95 ° C eingesetzt werden können, die die meisten Amyloide auf monomeres Protein wird wieder herzustellen.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Halt-Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-C extra Nitrocellulose</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>GB004 Blotting-Papier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>GB002 (3MM Chr) Blotting-Papier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

screening für amyloid-aggregation durch semi-denaturierenden detergens-agarose-gel-elektrophorese

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid-Aggregation ist mit zahlreichen Proteinfehlfaltung Pathologien und unterliegt der infektiösen Eigenschaften von Prionen, die konformativ sind selbsterklärend Templating Proteine, die vermutlich von Vorteil Rollen in niederen Organismen haben. Assoziiert Amyloide sind notorisch schwierig zu studieren aufgrund ihrer Unlöslichkeit und strukturelle Heterogenität. Allerdings hat eine Auflösung von Amyloid-Polymere auf Basis von Größe und Reinigungsmittel Unlöslichkeit Basis wurde möglich durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese (SDD-AGE). Diese Technik ist zu finden breite Anwendung für den Nachweis und die Charakterisierung von Amyloid-Konformations-Varianten. Hier zeigen wir, eine Anpassung dieser Technik, dass seine Verwendung erleichtert in großen Anwendungen, wie zum Beispiel Bildschirme für neuartige Prionen und anderen amyloidogenen Proteinen. Das neue SEPA-AGE-Methode verwendet Kapillartransfer für höchste Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit und ermöglicht Unternehmen jeder Größe Gel untergebracht werden. So kann eine große Anzahl von Proben, die aus Zellen oder gereinigte Proteine ​​hergestellt, gleichzeitig auf das Vorhandensein von SDS-unlöslichen Konformere markierte Proteine ​​weiterverarbeitet werden.

SDD-AGE ist eine nützliche Technik für die Erkennung und Charakterisierung von Amyloid-ähnlichen Polymeren in den Zellen. Hier zeigen wir eine Anpassung, dass diese Technik zugänglich großflächige Anwendungen macht.

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Die Amyloid-Aggregation ist mit zahlreichen Proteinfehlfaltungspathologien assoziiert und bildet die Grundlage für die infektiösen Eigenschaften von Prionen, welche ...

Hallo, ich bin Randall Hoffman, ein Doktorand im Labor von Susan Linus in der Biologieabteilung des MIT. Heute werde ich Ihnen die halbdenaturierende Detergens-Agarose-Gelelektrophorese, auch SDD-AGE genannt, vorstellen. Unser Labor nutzt diese Technik, um auf Prionen und andere amyloide Proteine zu screenen.Unsere Version des SDD-Alters ist einfach und zuverlässig und kann problemlos für jede Anzahl von Proben skaliert werden. Amyloide sind außergewöhnlich resistent gegenüber Denaturierung durch SDS, wodurch sie mithilfe der SDDH von anderen Proteinen getrennt werden können. Allerdings können Daten aus der SDDH allein nicht verwendet werden, um zu bestätigen, dass es sich bei einer Substanz um Amyloid handelt.Dazu müssen Sie andere Techniken anwenden. Vor diesem Hintergrund möchte ich Ihnen zeigen, wie das geht. S-D-D-H-S-D-D-H kann mit Standardausrüstung für horizontale DNA-Elektrophorese durchgeführt werden.Zunächst müssen Sie die Gießform für das Gel zusammenbauen. Die Größe der Apparatur hängt davon ab, wie viele Proben Sie haben. Bei einer großen Anzahl von Proben verwenden wir eine 20 mal 24 Zentimeter große Platte und bis zu vier Kämme mit je 50 Vertiefungen.Um das Gel vorzubereiten, benötigen Sie Agarose mit mittlerer oder hoher Gelfestigkeit und niedrigem EEO-Gehalt, 1× TAE-Puffer und eine 10%-ige Stammlösung von SDS. Stellen Sie eine 1,5%-ige Agaroselösung in 1× TAE her. Sie sollten das Gel so dick wie möglich anfertigen, um die maximale Probenmenge aufzuladen und die Detektion zu optimieren. Erhitzen Sie die Mischung in der Mikrowelle, bis die Agarose vollständig gelöst ist.Geben Sie den 100fachen XSDS-Stock schnell zu 0,1 % hinzu und schwenken Sie zur Vermischung. Falls sich während dieses Schritts etwas Agarose absetzt, lösen Sie diese auf einem Heizplättchen erneut auf. Achten Sie darauf, dass es nicht kocht.Nachdem SDS zugegeben wurde, kann die Lösung leicht überlaufen; gießen Sie die Lösung daher noch heiß in das Gießtablett. Verwenden Sie anschließend einen Kamm, um eventuelle Blasen zu entfernen, die später während der Gelelektrophorese stören könnten. Sobald das Gel vollständig abgekühlt und erstarrt ist, nehmen Sie den Kamm vorsichtig heraus und stellen das Gel in den Tank.Das Gel vollständig in einem XTAE mit 0,1 % SDS untertauchen. Nun können die Proben aufgetragen werden. Die in der SDDH verwendeten Proteinproben werden genauso wie bei einer SDS-Gelelektrophorese vorbereitet, mit zwei wichtigen Ausnahmen.Zunächst sollten Sie vermeiden, die Proben zu erhitzen, da dies die Aggregate in Proteinmonomere denaturieren könnte. Zweitens ist darauf zu achten, einen Proteinabbau zu vermeiden. Da die hier verwendeten denaturierenden Bedingungen nicht ausreichen, um alle Proteasen zu inaktivieren, empfehlen wir die Verwendung einer Proteaseinhibitor-Cocktail-Lösung in mindestens doppelter empfohlener Konzentration.In dieser Demonstration verwenden wir Lysate von Hefezellen, die ein bestimmtes Protein von Interesse überexprimieren. Üblicherweise verwenden wir zwei ml Übernachtkulturen, die in 96-Well-Blöcken von VWR gezüchtet wurden. Bei der Analyse von Proteinen mit geringer Abundanz müssen jedoch größere Kulturvolumina verwendet werden.Die Zellen durch Zentrifugation der Kultur bei 2000 RCF für fünf Minuten bei Raumtemperatur gewinnen; nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und die Zellen durch Resuspendierung in Wasser waschen und erneut zentrifugieren. Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt den Überstand entfernen und die Zellen in frischer Plating-Lösung resuspendieren. Die in der Lösung enthaltenen Enzyme verdauen die Zellwände, wodurch eine effiziente Lyse der Zellen mit einem geringen Volumen an Lysepuffer ermöglicht wird. 30 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren.Pelletieren Sie diesmal die überschüssigen Plastikzellen bei 800 RCF für fünf Minuten. Entfernen Sie das Überstand vollständig und resuspendieren Sie jedes Pellet in 100 Mikrolitern Lysepuffer. Bedecken Sie anschließend den Block mit Klebeband und führen Sie eine Vortex-Behandlung bei hoher Geschwindigkeit für zwei Minuten durch.Dadurch wird ermöglicht, dass alle sphärischen Kunststoffe LY P sind, um die zellulären Trümmer bei 4.000 RCF für zwei Minuten abzuzentrifugieren. Überführen Sie das S natin vorsichtig in eine 96-Well-PCR-Platte.Typischerweise analysieren wir in unserem Labor gleichzeitig Hunderte von Proben, weshalb wir ein Flüssigkeitsmanagementsystem verwenden. Falls gewünscht, bestimmen Sie die Protein-Konzentration der Lysate. Fügen Sie anschließend vierfach Puffer auf Probenbasis zu den Proben hinzu, um Lysate zu erzeugen, die einfachen Puffer auf Probenbasis enthalten, und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.Jetzt die Proben auf das Gel auftragen. Falls gewünscht, die Hälfte der Proben für die SDS-Page-Analyse aufbewahren. Außerdem molekulare Gewichtsmarker laden, einschließlich vorgefärbter Marker und eines Markers mit sehr hohem molekularem Gewicht, wie beispielsweise Hühnermuskelextrakt.Falls gewünscht, ist es wichtig, das Gel kühl zu halten, um eine Diffusion von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht zu verhindern; daher kann es sinnvoll sein, es im Kühlschrank laufen zu lassen. Führen Sie das Gel bei niedriger Spannung, weniger als drei Volt pro Zentimeter Gellänge, durch. Laufen Sie das Gel mehrere Stunden lang, bis sich das Diare etwa einen Zentimeter vom Ende des Gels entfernt hat.Da Amyloid bei Raumtemperatur nicht durch 2 % SDS denaturiert wird, bleibt es intakt, während andere Komplexe, einschließlich der meisten nicht-amyloiden Aggregate, in Gegenwart von 2 % SDS dissoziieren. Daher werden die meisten Proteine monomer sein und schnell durch das Gel wandern, während die SDS-resistenten Amyloide mit hohem Molekulargewicht langsamer wandern.Danach ist das Gel für die Übertragung bereit. Obwohl mehrere Übertragungsmethoden verwendet werden können, erzielen wir die besten Ergebnisse mit der kapillaren Übertragung. Da die kapillare Übertragung Gels jeder Größe verarbeiten kann, ist es praktisch, Hunderte von Proben mittels kapillarer Übertragung zu analysieren.Ein Stapel trockener Abblott-Papiere dient dazu, Puffer durch das Gel zu ziehen, wodurch Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen werden, die zwischen den Papieren und dem Gel platziert ist. Sie müssen ein Stück Nitrocellulose, beispielsweise High Bond C, zusätzlich in denselben Abmessungen wie das Gel zuschneiden. Außerdem müssen Sie 20 Stück GBO oh vier und acht Stück GBO oh zwei Abblott-Papier auf die gleiche Größe wie das Gel zuschneiden.GB oh vier ist sehr dick und saugfähig. GBO oh zwei hingegen ist viel dünner und hat eine feinere Textur, wodurch ein gleichmäßigerer Kontakt mit der Membran gewährleistet wird. Schneiden Sie ein zusätzliches Stück GBO oh vier als Docht zu und machen Sie es etwa 20 Zentimeter breiter als das eingetauchte Gel.Der nitrous UL WIC und vier Stücke GBO oh zwei und ein XTBS in einem Plastikbehälter setzen einen Stapel Papier wie folgt zusammen: 20 Stück trockenes GBO oh vier. Dann vier Stück trockenes GBO oh zwei. Dann ein Stück vorbefeuchtetes GBO oh zwei.Legen Sie die Nitrocellulose auf diesen Stapel. Spülen Sie das Gel auf dem Gießträger kurz mit Wasser, um überschüssiges Laufpuffer zu entfernen. Beginnen Sie dann vorsichtig, das Gel vom Träger auf den Stapel zu schieben, und benetzen Sie das Gel beim Herausschieben vom Träger bei Bedarf mit TBS.Das zusätzliche Puffer hilft dabei, zu verhindern, dass Blasen im Gel eingeschlossen werden. Die Transferpipette eignet sich gut für diesen Zweck, nachdem das Gel vollständig auf den Stapel übertragen wurde. Überprüfen Sie gründlich auf Blasen, falls vorhanden.Heben Sie den Rand des Gels an und geben Sie erneut Puffer hinzu, bis die Blasen herausgedrückt sind. Legen Sie die restlichen drei vorbenetzten GBO-ohne-zwei-Stücke auf das Gel. Stellen Sie einen vollständigen Kontakt zwischen allen Schichten her, indem Sie eine Pipette fest über den Stapel rollen.Platzieren Sie zwei erhöhte Behälter mit TBS, die die Transferanordnung flankieren, und legen Sie den vorbenetzten Docht so über den Stapel, dass beide Enden des Dochtes untergetaucht sind. Decken Sie den zusammengesetzten Transferstapel in TBS mit einem zusätzlichen Plastikbehälter ab, der zusätzliches Gewicht trägt, beispielsweise eine 500-ml-Wasserflasche. Der Docht saugt Puffer aus den Behältern, und das trockene Blottingpapier zieht den Puffer im Laufe mehrerer Stunden durch das Gel.Dadurch werden die Proteine auf die Membran aufgetragen; der Transfer sollte mindestens drei Stunden lang oder über Nacht fortgesetzt werden. Nach Abschluss des kapillaren Transfers kann die Membran mit einer Standard-Western-Blot-Analyse weiterverarbeitet werden. Hier sehen Sie einen typischen Blot von Proteinen, die in einem Hefestamm überexprimiert wurden und bestimmte Proteine zur Bildung von Amyloid neigen lassen.Sie können deutlich erkennen, dass einige unserer Kandidaten Amyloid- oder hochmolekulare, SDS-resistente Spezies sehr gut bilden, wie hier und hier gezeigt. Andere hingegen bilden keine Aggregate und sind vollständig monomer, wie beispielsweise diese und diese. Zusätzlich sehen Sie, dass die Größe der Amyloid-Polymere je nach Protein variiert, was Sie in diesen beiden Bahnen erkennen können.Wir haben Ihnen soeben eine einfache Methode zur Analyse von hochmolekularen, unlöslichen Aggregaten, wie Amyloiden von potenziellen Prionen, gezeigt. Wir hoffen, dass Ihnen unsere Präsentation gefallen hat und dass Sie diese Technik als nützlich für Untersuchungen amyloider immunogener Proteine erachten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrer Forschung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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