Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen
27. Oktober 2008
Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.
Dieses Verfahren beginnt mit der Fixierung, Methanol- und Proteinase-K-Behandlung der Embryonen, gefolgt von einer Inkubation über Nacht mit einer Sonde einen Diggen oder einem Diggen und Sonde. Zwei Fluorescein-Isothiocyanat- oder ZI-Embryonen werden nach einer Farbreaktion mit dig-alkalischer Phosphatase mit dig-Antikörpern inkubiert. Die Aktivität wird inaktiviert und die Embryonen werden inkubiert.
Mit FSE wird eine Farbreaktion mit Zi durchgeführt und die Embryonen werden fixiert. Hallo, ich bin Delphine aus dem Labor von Rick Finnel am Center for Environmental and Genomic Medicine an der Texas a and m University in Houston. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Durchführung einer Situ-Hybridisierung mit zwei Farbstoffen im Hühnerembryo.
Mit diesem Verfahren analysieren wir im Labor die Wirkung von Antiepileptika auf Magen- und Nervengene. Fangen wir also an: Um eine In-situ-Hybridisierung an Hühnerembryonen durchzuführen, öffnen Sie zunächst ein Ei, indem Sie mit einer Pinzette auf die Schale klopfen und Teile der Schale entfernen. Entfernen Sie das dicke Albumin mit einer Pinzette und kippen Sie den Dottersack mit einer groben Zange so, dass der Embryo mit einer feinen Schere nach oben zeigt.
Schneide ein Quadrat Dottersack um den Embryo herum. Nehmen Sie den Embryo mit einem Löffel aus dem Eigelb und legen Sie ihn in eine Schüssel mit Eis. Kalte PBS unter einem Präpariermikroskop Entfernen Sie vorsichtig die Membranen und die Säure und geben Sie den Embryo in eine frische Schale mit Eis.
Kaltes PBS hält den Embryo mit einer Pinzette fest und aspiriert das PBS im Abzug. Ersetzen Sie dies durch 4% Paraformaldehyd in dey PBS und lassen Sie den Embryo über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren. Nachdem die Embryonen fixiert sind, aspirieren Sie die Fixierlösung und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß als chemischen Abfall.
Füllen Sie die Schale mit eiskaltem PBS mit einer Mikrokapillarnadel mit stumpfem Ende oder einem Mikrodissektionsmesser, perforieren Sie den Kopf und die Herzhöhlen. Um ein Einklemmen der Sonde zu verhindern. Legen Sie die Embryonen in DEP CPBS mit 0,1 % Tween 20 und dehydrieren Sie die Embryonen dann in einer Methanol-Serie für jeweils 10 Minuten in 25 %50 %75 % und 100 % Methanol in PBT.
Wiederholen Sie die Wäsche mit 100 % Methanol. Die Embryonen dürfen nun bei minus 20 Grad Celsius in Methanol gelagert werden. In 20 Milliliter Glasszintillationsfläschchen.
Um die In-situ-Hybridisierung durchzuführen, ist es notwendig, die Embryonen zunächst zu rehydrieren. Waschen Sie dazu die Embryonen jeweils 10 Minuten in 75%50% und 25%Methanol in PBT. Zum Schluss zweimal für jeweils 10 Minuten waschen.
Bei PBT die PBT-Lösung aus den Durchstechflaschen nehmen und durch eine Proteinase-K-Lösung von fünf Mikrogramm pro Milliliter ersetzen. Drei Milliliter pro Fläschchen. Rollen Sie das Fläschchen vorsichtig aus, um sicherzustellen, dass der gesamte Inhalt der Proteinase-K-Lösung ausgesetzt ist.
Lassen Sie die Proteinase-K-Lösung je nach Embryostadium ein bis fünf Minuten einwirken. In der Zwischenzeit bereiten Sie mit einer RNA-freien Pipette eine eiskalte Fixierlösung vor, entfernen Sie die Proteinase-K-Lösung und fügen Sie zwei Milliliter der Fixierlösung hinzu. Stellen Sie das Fläschchen sofort genau 20 Minuten lang auf Eis.
Waschen Sie die Embryonen anschließend bei Raumtemperatur auf einem Mutator. Führen Sie zwei 10-minütige Wäschen in PBT durch, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche in 50%iger Hybridisierungspuffer in PBT. Waschen Sie die Embryonen dann einmal in 100%igem Hybridisierungspuffer und inkubieren Sie sie vier bis fünf Stunden lang in zwei Millilitern Hybridisierungspuffer.
Bei 65 Grad Celsius. Die Embryonen sind nun bereit für die Hybridisierung mit Sonden, graben und fitzy gekoppelte Sondensynthese wird im unterstützenden Material beschrieben. Die Sonde, von der erwartet wird, dass sie ein starkes Signal liefert, sollte mit FSE-haltigen Nukleotiden synthetisiert werden, während die schwächeren Sonden mit Dig-haltigen Nukleotiden synthetisiert werden sollten.
Sonden im Hybridisierungspuffer mit einem Zwei-Milliliter-Fläschchen vorwarnen. Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer von den Embryonen und ersetzen Sie den Hybridisierungspuffer umgehend durch die Sondenlösung. Es ist wichtig, die Embryonen nicht 16 Stunden lang bei 65 Grad Celsius trocken inkubieren zu lassen.
Ersetzen Sie nach dem Schritt der Sondenhybridisierung die Sondenlösung durch einen Hybridisierungspuffer. Führen Sie zwei 30-minütige Wäschen bei 65 Grad Celsius durch und waschen Sie dann erneut 15 Minuten lang in einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Hybridisierung, Puffer und Maleinsäurepuffer bei 65 Grad Celsius. Nach diesem Schritt müssen Sie keine RNAs-freien Bedingungen mehr verwenden.
Jetzt können Sie die Dig-Farbreaktion durchführen, gefolgt von der Fitz-Farbreaktion. Um die Antikörperhybridisierung und die Farbreaktion durchzuführen, waschen Sie die Embryonen zunächst zweimal für jeweils 20 Minuten in Maleinsäurepuffer. Dann eine Stunde lang in 2%VBR in Maleinsäurepuffer waschen.
Zum Schluss beobachten Sie fünf Stunden lang im Blockierungspuffer, verdünnen Sie den Antikörper eins bis 2000 in Blockierungspuffer und inkubieren Sie die Embryonen in dieser Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Mutator. Am nächsten Tag führen Sie drei 10-minütige Waschungen in Maleinsäurepuffer durch, gefolgt von drei einstündigen Waschungen in Maleinsäurepuffer. Zweimal für je 20 Minuten waschen.
In NTMT fügen Sie 200 Mikroliter N-B-T-B-C-I-P-Substrat zu 10 Millilitern hinzu. NTMT Entfernen Sie NTMT sofort mit dem Embryo aus der Durchstechflasche und ersetzen Sie es durch ein bis zwei Milliliter. N-B-T-B-C-I-P Pufferplatz im Dunkeln.
Überwachen Sie die Farbreaktion nach 20 Minuten und danach in 20-Minuten-Intervallen. Wenn sich die blaue Farbe entsprechend entwickelt hat, waschen Sie die Embryonen 10 Minuten lang in PBS. Ersetzen Sie dann das PBS durch 4%Paraformaldehyd in PBS.
Über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren. Übertragen Sie den Embryo in ein neues Syn-Installationsfläschchen, waschen Sie es zweimal für jeweils 10 Minuten in PBT, gefolgt von zwei 10-minütigen Waschungen in Maleinsäurepuffer. Inkubieren Sie die Embryonen 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius in Maleinsäurepuffer
.Jetzt ist es an der Zeit, die zweite Antikörperinkubation und Farbreaktion durchzuführen. Um unsere zweite markierte Sonde zu erkennen, waschen Sie die Embryonen zweimal für jeweils 10 Minuten in Maleinsäurepuffer. Eine Stunde in 2%BBR in Maleinsäurepuffer.
Und dann fünf Stunden in Blockierungspuffer, verdünnen Sie den alkalischen Phosphatase-gekoppelten Anti-FTSE-Antikörper um eins zu 500 in Blockpuffer und inkubieren Sie die Embryonen in dieser Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen wurden drei 10-minütige Waschungen in Maleinsäurepuffer durchgeführt, gefolgt von drei einstündigen Waschungen in Maleinsäurepuffer. Anschließend zweimal für jeweils 20 Minuten waschen.
Bereiten Sie in Tris HCL fünf Milliliter Vektorrot-Arbeitslösung in Tris HCL gemäß dem Protokoll des Herstellers vor. Entfernen Sie sofort das Triss HCL aus der Durchstechflasche und ersetzen Sie es durch den roten Vektorpuffer. Stellen Sie die Fläschchen in die Dunkelheit.
Überwachen Sie die Farbreaktion nach 30 Minuten und in Abständen von 30 Minuten danach, nachdem sich die rote Farbe entwickelt hat, übertragen Sie die Embryonen auf PBS. Sie sind endlich bereit, die Embryonen zu fixieren und zu verarbeiten. Übertragen Sie sie in eine Fixierschale mit 4% Paraform, Aldehyd und fixieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius.
Zweimal 10 Minuten pro Waschgang in PBS waschen, um es für die Fotografie zu verarbeiten. Übertragen Sie die Embryonen auf 20% Glycerin in PBS. Dadurch werden die Embryonen durchscheinend, um sie für die Wachsschnitte zu verarbeiten.
Übertragen Sie die Embryonen zurück auf PBS, waschen Sie sie zweimal für jeweils 10 Minuten, dehydrieren Sie sie in einer Methanolserie für jeweils 10 Minuten, ersetzen Sie das Methanol durch Propanol und inkubieren Sie sie drei Minuten lang. Entfernen Sie das Propanol und ersetzen Sie es durch 1 2 3 4 Tetra Hydro Nap Filin für 20 Minuten, gefolgt von Histo Clear, zwei Wäschen für jeweils eine Stunde. Durch eine Eins-zu-Eins-Mischung aus Histo Clear und Wachs ersetzen und eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius inkubieren.
Ersetzen Sie diese Lösung durch Wachs und Verfahren für die Histologie. Dieser Embryo ist mit einem Digo-Sauerstoff in den Socken, zwei Sonden in Blau und einer Fitzy-Delta-Sonde in Rot gekennzeichnet. Die erste Farbreaktion zeigt das Ausdrucksmuster von Socken. Zwei.
Ein Marker für die Neuralplatte, der im Labor von Dr.Robin entwickelt wurde, Level Badge Sox, zwei positive Zellen erscheinen nach der Reaktion mit N-B-T-B-C-I-P blau. Derselbe Embryo wird dann für die zweite Farbreaktion aufbereitet, die das Expressionsmuster von Delta Eins enthüllt. Ein Marker für die Segmentplatte, der im Labor von Dr. Domingo Enrique Delta entwickelt wurde, zeigt eine positive Zelle, die nach der Reaktion mit dem Vektor rot rot erscheint.
Dieser Embryo ist mit einem Digo in PAC, sechs Sonden in Blau und einer fitzy SHH-Sonde in Rot markiert. Die erste Farbreaktion zeigt das Expressionsmuster von PAC six, einem Marker für die neuralen Falten und sich entwickelnden Somiten, der im Labor von Dr. Martin Goulding Pac entwickelt wurde. Sechs positive Zellen erscheinen nach der Reaktion mit N-B-T-B-C-I-P blau.
Die zweite Farbreaktion zeigt das Expressionsmuster des SHHA-Markers für die Noor und die ventrale Mittellinie des Neuralrohrs, das im Labor von Dr. Cliff Tabban entwickelt wurde. SHH-positive Zellen erscheinen nach Reaktion mit dem Vektor Rot rot. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Farb- und C-Hybridisierung im Hühnerstall durchführen können.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, sowohl mit Tiefe C behandelte Lösungen als auch Autoklaven, PFAS und sterile vi zu verwenden. Um den Kontakt mit RNAs zu minimieren, erfolgt in den Schritten drei bis fünf. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Video zeigt eine 2-Farben-Ganzpräparat-In-situ-Hybridisierung, eine Technik zur Visualisierung der räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster von zwei verschiedenen Genen in jungen Hühnerembryonen. Das Verfahren umfasst die Fixierung, Behandlung mit Methanol und Proteinase K sowie die Inkubation mit spezifischen Sonden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Genexpression
Hintergrund
- Die In-situ-Hybridisierung an Ganzpräparaten ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in Embryonen.
- Diese Methode wurde ursprünglich von namhaften Forschern auf diesem Gebiet eingeführt.
- Das Verständnis von Expressionsmustern von Genen ist entscheidend für die Entwicklungsbiologie.
- Hühnerembryonen dienen als Modellorganismus für derartige Untersuchungen.
Zweck der Studie
- Um die Expressionsmuster von zwei Genen gleichzeitig zu visualisieren.
- Um eine detaillierte Methodik für Forschende auf diesem Gebiet bereitzustellen.
- Um das Verständnis von Genwechselwirkungen während der embryonalen Entwicklung zu vertiefen.
Verwendete Methoden
- Fixierung von Hühnerembryonen.
- Behandlung mit Methanol und Proteinase K.
- Inkubation mit Digoxigenin-markierten Sonden.
- Farbreaktion mit Antikörpern zur Visualisierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Genexpressionsmustern in Embryonen.
- Nachweis der Wirksamkeit der Zweifarbenmethode.
- Deutliche Unterscheidung der Orte der Genexpression.
- Mögliche Anwendungen in der Entwicklungsbiologieforschung.
Schlussfolgerungen
- Die zweifarbige Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung ist eine wertvolle Technik.
- Diese Methode kann auf verschiedene Studien zur Genexpression angewendet werden.
- Weitere Forschung kann ihre Anwendungen in der Entwicklungsbiologie erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung von zwei Genexpressionsmustern in Hühnerembryonen und unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken bei der frühen Zielvalidierung. Durch die räumliche und zeitliche Auflösung der Gen-Koexpression wird das Vorhersagevertrauen in der Pfadanalyse während der Entdeckungsforschung erhöht. Der Ansatz ist besonders relevant für die Untersuchung von Zielstrukturen in der neurodevelopmentellen und kardiovaskulären Entwicklung, bei der embryonale Modelle Aufschluss über die translationale Relevanz geben.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem er die Ko-Expressionsmuster von Signalproteinen und Transkriptionsfaktoren in sich entwickelnden Geweben aufdeckt.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch die räumliche Abbildung der Genaktivität in Neuralrohr, Somiten und Herzanlagen.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Projektportfolios, indem er die mechanistischen Zusammenhänge zwischen Genen aufklärt, die an Entwicklungsprozessen beteiligt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Verbindungsscreening vor, indem Baseline-Expressionsprofile etabliert werden.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt räumlich aufgelöste, farbmetrische Signale, die den Vergleich der Genexpression unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Reproduzierbarkeit: Standardisierte Fixierungs- und Hybridisierungsschritte unterstützen die Assay-Standardisierung über verschiedene Labore hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheit: Verbindet die embryonale Genexpression mit der postnatalen Pathophysiologie bei neurodevelopmentalen und kardialen Erkrankungen.
- Translationale Kontinuität: Schließt die Lücke zwischen Entdeckungen und präklinischen Modellen, indem die Expression von Zielstrukturen in krankheitsrelevanten Systemen validiert wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Bindung an Zielstrukturen in sich entwickelndem Gewebe vor Studien an Säugetiermodellen bestätigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in die Entdeckungsbiologie-Phase eingebettet und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die Aufklärung von Signalwegen, bevor mit der Identifizierung von Leitverbindungen begonnen wird.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die mechanistische Entrisikobewertung durch Visualisierung der koexprimierten Gene in sich entwickelnden Embryonen und klärt funktionelle Beziehungen zwischen Zielstrukturen.
- Screening: Erzeugt räumlich aufgelöste Expressionsdaten, die die Assay-Entwicklung für die Wirkstoffscreening in relevanten Geweben unterstützen können.
- Analytik: Liefert zweifarbige kolorimetrische Nachweise, die einen quantitativen Vergleich von Genexpressionsmustern unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Biomarker-Korrelierung, indem sie die Expression entwicklungsgenetischer Marker in für menschliche Erkrankungen relevanten Geweben bestätigt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Validierung mehrerer Genziele über verschiedene Entwicklungszeitpunkte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten, indem räumliche Beziehungen zwischen koexprimierten Genen in sich entwickelnden Geweben aufgezeigt werden.
- Operativer Wert: Ein standardisierter Protokollablauf gewährleistet Reproduzierbarkeit über verschiedene Labore und experimentelle Ansätze hinweg.
- Strategischer Wert: Erhöht die Zuversicht bei der Zielstrukturauswahl und verringert späte Fehlschläge aufgrund falscher mechanistischer Annahmen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierter Expression in krankheitsrelevanten embryonalen Systemen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in embryologischer Dissektion und molekularer Hybridisierungstechniken.
- Setzt Zugang zu Dissektionsmikroskopen, Hybridisierungsöfen und kolorimetrischen Nachweissystemen voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Sonden-Synthese und Antikörper-Titration zwischen verschiedenen Anwendern.
- Die Anpassung an alternative Modellsysteme kann eine Optimierung der Fixierungs- und Permeabilisierungsschritte erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Verfügbarkeit von Embryonen, die entwicklungsspezifische Permeabilität sowie Begrenzungen bei der Signal-Multiplexierung über zwei Farben hinaus.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
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Title
0:49
Introduction
1:16
Fixing and Dehydrating the Embryos
3:28
Prehybridzation
5:15
Hybridizing Embryos with DIG- and FITC- Coupled Probes
6:41
DIG Antibody Incubation and Color Reaction
9:40
FITC Antibody Incubation and Color Reaction
11:52
Fixation and Processing
13:34
Results
15:08
Conclusion
