Reaggregieren Thymus Kulturen

Hallo, ich bin Andrea White und komme aus dem Labor von Graham Anderson und Eric Jenkinson am MRC Center for Immune Regulation an der University of Birmingham. Heute stelle ich ein Protokoll zur Gewinnung von reaggregierten Thymus-Organkulturen vor, das zur Untersuchung komplexer zellulärer Wechselwirkungen verwendet werden kann, die während der T-Zell-Differenzierung auftreten. Vor Beginn dieses Verfahrens wurden embryonale Thymuslappen isoliert und behandelt, um alle Lymphozyten zu entfernen.

Dies ist in einem separaten Video zu sehen. Die Alienoid-Lappen werden dann disaggregiert, um ein Stromazellpräparat herzustellen. Und schließlich werden die Zellen aggregiert, um eine re-aggregierte fmic Organkultur zu bilden.

Fangen wir an. Nach fünf bis sieben Tagen in Kultur sollte der LO bereit sein, für die Vorbereitung auf Schwarmzellen zu disaggregieren. Tauchen Sie die 0,8-Mikrometer-Filter in eine Petrischale, die RPMI 1640 plus 10 % FCS enthält. Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig alle Faserhängen ab, die nicht abschwimmen. Verwenden Sie eine Milliliter pro Haustier, um die Keulen auf eine 1,5 mil Röhre zu übertragen.

Wir empfehlen nicht mehr als 50 Lappen pro Orph-Röhrchen. Lassen Sie die Lappen unter der Schwerkraft der Einheit am Boden des Rohrs absetzen und entfernen Sie das Medium. Waschen Sie die Lappen mit einer mil PBS und lassen Sie die Lappen dann wieder auf den Boden sinken.

Wiederholen Sie dies für insgesamt drei PBS-Wäschen, entfernen Sie die letzte PBS-Wäsche und fügen Sie 600 Mikroliter eines 0,25%igen Trips in Lösung hinzu. Legen Sie das Einor-Sonde für 25 Minuten in einen 37-Grad-Inkubator. Tritrieren Sie die Lappen vorsichtig mit einer blauen Spitze von 1 mil auf einem Perpet für 10 Sekunden und legen Sie sie dann nach 20 Minuten wieder in den Inkubator, pipettieren Sie die Lappen auf und ab, um sie vollständig zu disaggregieren.

Es sollte etwa 30 Sekunden dauern Um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten, fügen Sie 400 Mikroliter eiskalt, RPMI 1640 plus 10% FCS hinzu, um das Trypsin-Imp-Pellet zu neutralisieren, Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei tausend U/min, 10 Minuten bei vier Grad C, entfernen Sie das Substrat und resuspendieren Sie das Pellet in einer Mil. RPMI 1640 plus 10%FCS auf Wunsch. Zellen zählen.

Typischerweise würden wir etwa 50.000 Zellen pro Dioxazinlappen erwarten, ausgehend von einem E 15-Faserstoff. Nun sind wir bereit, die aggregierten fmic Corgan-Kulturen in einem eineinhalb mil enden Orph-Röhrchen zu formen. Gemischte, frisch zubereitete feine Stromazellen.

Zusammen mit vorselektierten CD vier positiven CD acht positiven Fibrozyten. Wir empfehlen ein Verhältnis von Stromazellen zu Fibrozyten von etwa eins zu eins. Die Anzahl der Zellen, die Sie verwenden, hängt von der Anzahl der verfügbaren Zellen und den durchzuführenden Experimenten ab.

Wir empfehlen insgesamt mindestens hunderttausend Zellen und nicht mehr als 1,5 Millionen Zellen. Sie möchten, dass die V-Aggregate groß genug sind, um reproduzierbar zu sein, aber nicht so groß, dass das Zentrum die Pelletzellen durch Zentrifugieren bei tausend Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten stirbt. Bauen Sie den Organkulturfilter bei vier Grad C vorsichtig zusammen.

Entfernen Sie alle SUP-Natin nach und nach mit einem P 200 pro Haustier. Die Wirbelzelle pelletiert 10 Sekunden lang, um eine Aufschlämmung zu bilden. Das Volumen sollte etwa ein bis zwei Mikroliter Mund betragen.

Streicheln Sie die Gülle in ein fein gezogenes Haustier und halten Sie die Suspension der Zellen an der Spitze des Haustieres. Unter unserem Präpariermikroskop wird die Zellaufschlämmung vorsichtig mit PET in die Mitte eines 0,8-Mikrometer-Filters gespritzt. Idealerweise werden die Zellen als stehender Tropfen in einem Kreis von ein bis zwei Millimetern Durchmesser platziert.

Wenn sich die Aufschlämmung auszubreiten beginnt, lassen Sie die Flüssigkeit in der Aufschlämmung durch den Po ablaufen, bevor Sie die restlichen Zellen ablagern. Stellen Sie die Schüssel in eine Plastik-Sandwichdose und verschließen Sie sie. Was Thymus-Organkulturen anbelangt, bei denen wir eine Box in einen Inkubator stellen, so aggregieren wir die Kulturen, die sich innerhalb von 18 Stunden nach der Kultur zu intakten Strukturen formen.

Nach vier bis fünf Tagen Kultivierung werden sie sowohl Zöliakie vier positive acht negative als auch vier negativ acht positive reife Cyten-Untergruppen erzeugen. Beginnend mit 50 Dioxazin-behandelten Lappen sollten genügend Stromazellen für die Herstellung von drei bis fünf Reaggregatkulturen vorhanden sein. Diese Kulturen erscheinen typischerweise als zusammenhängende Zellhügel, die mit einer Pinzette von den Filtern geschoben werden können, ohne sie zu beschädigen.

Wir haben soeben die Methode beschrieben, mit der die positive Selektion durch F-Epithelzellen untersucht werden kann. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die durch dendritische Zellen vermittelte negative Selektion zu untersuchen. Schließlich durch die Verwendung von TCR-transgenen FIBROZYTEN oder MHC-Klasse-1-defizienten oder MHC-Klasse-2-defizienten Stromazellen.

Dieses System ermöglicht getrennte Untersuchungen der Selektion von Zölia-4-positiven oder Cöl-Acht-positiven T-Zellen. Vielen Dank fürs Einschalten.