Name: Reaggregieren Thymus Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Reaggregat-Thymuskulturen zur Untersuchung der T-Zell-Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Interaktionen in der Immunforschung.

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Für weitere Informationen über die Vorbereitung reggregate Thymus Kulturen besuchen Sie bitte die <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a> .

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
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In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reaggregieren thymus kulturen

Reaggregate Thymus Cultures

In der Thymusdrüse, unreifen CD4 +8 + Thymozyten exprimieren vertauschten T-Zell-Rezeptor-α-und b-Ketten-Gene unterziehen positive und negative Selektion Ereignisse auf ihre Fähigkeit, self-peptide/major (MHC)-Moleküle durch Thymus exprimiert erkennen Basis Stromazellen. In vivo Analyse der Rolle des Thymus Stromazellen während intrathymischen Auswahl wird dadurch erschwert, durch die zelluläre Komplexität des Thymus Mikroumgebung in der steady-state adulten Thymus und durch das Fehlen geeigneter Targeting-Strategien, um die Genexpression insbesondere Thymus Stromatumoren Fächer zu manipulieren. Wir haben gezeigt, dass die Thymus-Mikroumgebung leicht in vitro werden durch den Einsatz von reaggregieren Thymus Organkulturen, das die Herstellung von dreidimensionalen Thymus Lappen aus definierten Stroma-und lymphatischen Zellen ermöglichen manipuliert. Auch wenn andere in vitro-Systeme einige Aspekte der T-Zell-Entwicklung zu unterstützen, reaggregieren Thymus Organkultur bleibt die einzige in-vitro-System in der Lage, effiziente MHC-Klasse-Support I und II-vermittelte Thymozyten Auswahl Veranstaltungen und so als ein wirksames Instrument zur Untersuchung verwendet werden kann die zelluläre und molekulare Regulation von positiven und negativen Selektion im Thymus.

In diesem Video die Herstellung von 2-dGuo behandelten reaggregieren Thymus Kulturen demonstriert.

Reaggregieren Thymus Kulturen

Stromazellen in lymphoiden Geweben sind in dreidimensionalen Strukturen organisiert, die ein Gerüst bilden, von dem angenommen wird, dass es die Migration und ...

Hallo, ich bin Andrea White aus dem Labor von Graham Anderson und Eric Jenkinson am MRC-Zentrum für Immunregulation der Universität Birmingham. Heute stelle ich eine Anleitung zur Herstellung von reaggregierten thymischen Organkulturen vor, die zur Untersuchung komplexer zellulärer Interaktionen während der T-Zell-Differenzierung verwendet werden können. Vor Beginn dieses Verfahrens wurden embryonale Thymuslappen isoliert und behandelt, um alle Lymphozyten zu entfernen.Dies ist in einem separaten Video zu sehen. Die Alienoid-Lappen werden anschließend disaggregiert, um eine stromale Zellpräparation herzustellen. Schließlich werden die Zellen zu einer reaggregierten fmic-Organkultur zusammengefasst.Beginnen wir. Nach fünf bis sieben Tagen in Kultur sollten die LOs bereit sein, für die Herstellung von Schwarmzellenpräparationen disaggregiert zu werden. Tauchen Sie die 0,8-Mikrometer-Filter in eine Petrischale mit RPMI 1640 plus 10 % FCS. Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig alle Faserhange ab, die nicht von alleine abgehen. Verwenden Sie eine 1-mL-Pipette, um die Lappen in ein 1,5-mL-Eppendorf-Röhrchen zu überführen.Wir empfehlen nicht mehr als 50 Lappen pro Eppendorf-Röhrchen. Lassen Sie die Lappen durch Einheitsgravitation auf den Boden des Röhrchens sedimentieren und entfernen Sie das Medium. Waschen Sie die Lappen mit einem Milliliter PBS und lassen Sie die Lappen anschließend erneut auf den Boden absinken.Wiederholen Sie dies insgesamt dreimal mit PBS-Spülungen, entfernen Sie die letzte PBS-Spülung und geben Sie 600 Mikroliter einer 0,25 %igen Trips-Lösung hinzu. Stellen Sie das Eppendorf-Röhrchen 25 Minuten lang in einen 37-Grad-Inkubator. Pipettieren Sie die Lappen vorsichtig mit einer 1-mL-blauen Spitze an einem Pipettiergerät für 10 Sekunden und stellen Sie sie danach erneut 20 Minuten lang in den Inkubator. Anschließend pipettieren Sie die Lappen mehrmals auf und ab, um sie vollständig zu dispergieren.Es sollte ungefähr 30 Sekunden dauern. Um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, geben Sie 400 Mikroliter eiskaltes RPMI 1640 plus 10 % FCS hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei tausend U/min, 10 Minuten bei vier Grad C, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI 1640 plus 10 % FCS, falls gewünscht. Zählen Sie die Zellen.Typischerweise würden wir ausgehend von einem E15-fibrösen Gewebe etwa 50.000 Zellen pro Dioxazin-Lappen erwarten. Nun sind wir bereit, die Aggregatkulturen von fmic-Corgan in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen zu bilden. Gemischt, frisch präparierte feine stromale Zellen.Zusammen mit vorabselektierten CD4-positiven CD8-positiven Fibrozyten. Wir empfehlen ein Verhältnis von etwa 1:1 zwischen Stromazellen und Fibrozyten. Die Anzahl der Zellen, die Sie verwenden werden, hängt von der verfügbaren Zellzahl und den durchzuführenden Experimenten ab.Wir empfehlen insgesamt mindestens hunderttausend Zellen und nicht mehr als 1,5 Millionen Zellen. Die V-Aggregate sollten groß genug sein, um reproduzierbar zu sein, aber nicht so groß, dass das Zentrum abstirbt. Pelleten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei eintausend U/min für 10 Minuten. Bei vier Grad Celsius setzen Sie den Organkulturfilter sorgfältig zusammen.Entfernen Sie vollständig das a SUP natin im Stadium mit einem P 200 pro Petrischale. Vortexen Sie das Zellpellet 10 Sekunden lang, um eine Suspension zu bilden. Das Volumen sollte etwa ein bis zwei Mikroliter betragen.Befördern Sie die Suspension mit einem fein gezogenen Pipettenspitzenende auf den Filter, wobei die Zellsuspension an der Spitze der Pipette gehalten wird. Unter dem Stereomikroskop bringen Sie die Zellsuspension vorsichtig mundpipettierend in die Mitte eines 0,8-Mikrometer-Filters auf. Idealweise sollten die Zellen als stehender Tropfen in einem Kreis mit einem Durchmesser von ein bis zwei Millimetern aufgebracht werden.Wenn die Suspension anfängt, sich auszubreiten, lassen Sie die Flüssigkeit in der Suspension durch das Pos ablaufen, bevor Sie die verbleibenden Zellen absetzen. Stellen Sie die Schale in eine Kunststoff-Sandwichbox und verschließen Sie sie. Wie bei Thymus-Organkulturen aggregieren sich die Kulturen innerhalb von 18 Stunden nach der Kultivierung zu intakten Strukturen, und stellen Sie eine Box in einen Inkubator.Nach vier bis fünf Tagen der Kultur bilden sie sowohl reife Zellsubpopulationen mit CD4-positiv/CD8-negativ als auch CD4-negativ/CD8-positiv aus. Der Ansatz mit 50 mit Dioxazin behandelten Lappen sollte ausreichend Stromazellen liefern, um drei bis fünf Reaggregatkulturen anzulegen. Diese Kulturen erscheinen typischerweise als zusammenhängende Zellhaufen, die mithilfe einer Pinzette problemlos von den Filtern abgelöst werden können, ohne sie zu beschädigen.Wir haben soeben die Methode beschrieben, mit der die positive Selektion durch F-Epithelzellen untersucht werden kann. Diese Methode kann ebenfalls zur Untersuchung der dendritischen Zell-vermittelten negativen Selektion verwendet werden. Schließlich, durch Verwendung von TCR-transgenen FIBROZYTEN oder MHC-Klasse-eins-defizienten bzw. MHC-Klasse-zwei-defizienten Stromazellen.Dieses System ermöglicht getrennte Untersuchungen der Selektion von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Zellen. Vielen Dank fürs Zuschauen.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt die Zerlegung und Entfernung der fetalen Thymus sowie die Vorbereitung der ex vivo Kulturen von 2-dGuo behandelten Thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Erzeugung funktioneller antigenspezifischer T-Zellen aus iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen unter Verwendung eines dreidimensionalen Thymuskultursystems. Die Co-Kultivierung der iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen mit endogenen lymphozytendepletierten Mäusen aus fetalen Thymuslappen führte zu einer erfolgreichen Reifung der T-Zellen zur Bildung von CD8αβ+ MHC-Klasse I+ iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten (iTEs).

Dreidimensionales Thymuskultursystem zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Dieser Artikel beschreibt in vivo und in vitro Methoden zur Charakterisierung der thymusabsetzenden Vorläuferzellen durch die Analyse der Kinetik der Erzeugung, des Phänotyps und der Anzahl ihrer T-Zell-Nachkommen.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Anreicherung von Thymusepithelzellen (TECs) mit einem Dichtegradienten für die FACS-Isolierung. Es zeigt auch die Verwendung von EAK16-II/EAKIIH6-Peptiden zur Förderung der TEC-Aggregatbildung. Die Mikroumgebungen des Hydrogels EAK16-II/EAKIIH6 bieten die 3-D-Konfiguration, die zur Aufrechterhaltung des Überlebens und der Funktion der TECs erforderlich ist.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie.

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von doppelt negativen Thymozyten aus dem Thymus der Maus, gefolgt von retroviraler Transduktion und Co-Kultur auf dem delta-like 4-exprimierenden Knochenmark-Stroma-Zelllinien-Co-Kultursystem (OP9-DL4) zur weiteren funktionellen Analyse.

Kokultur und Transduktion von murinen Thymozyten auf Delta-ähnlichen 4-exprimierenden Stromazellen zur Untersuchung von Onkogenen bei T-Zell-Leukämie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Bildung von humanen iPSC-abgeleiteten Thymus-Organoiden, die in 3D-Fibrin-Hydrogelen gezüchtet werden, um die Reifung der Thymusepithelzellen (TEC) und deren verlängerte Erhaltung sowie die Thymopoese in vitro zu unterstützen.

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Lernen Sie die Herstellung von Reaggregat-Thymuskulturen zur Untersuchung der T-Zell-Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Interaktionen in der Immunforschung.

Reaggregieren Thymus Kulturen

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