Name: Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von fetalen Thymus-Organkulturen mit 2-dGuo-Behandlung zur Untersuchung der T-Zell-Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die Analyse lymphoider Zellinteraktionen in vitro.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
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In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

herstellung von 2-dguo-behandelte thymus organkulturen

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In der Thymusdrüse, unreifen CD4 +8 + Thymozyten exprimieren vertauschten T-Zell-Rezeptor-α-und b-Ketten-Gene unterziehen positive und negative Selektion Ereignisse auf ihre Fähigkeit, self-peptide/major (MHC)-Moleküle durch Thymus exprimiert erkennen Basis Stromazellen. In vivo Analyse der Rolle des Thymus Stromazellen während intrathymischen Auswahl wird dadurch erschwert, durch die zelluläre Komplexität des Thymus Mikroumgebung in der steady-state adulten Thymus und durch das Fehlen geeigneter Targeting-Strategien, um die Genexpression insbesondere Thymus Stromatumoren Fächer zu manipulieren. Wir haben gezeigt, dass die Thymus-Mikroumgebung leicht in vitro werden durch den Einsatz von reaggregieren Thymus Organkulturen, das die Herstellung von dreidimensionalen Thymus Lappen aus definierten Stroma-und lymphatischen Zellen ermöglichen manipuliert. Auch wenn andere in vitro-Systeme einige Aspekte der T-Zell-Entwicklung zu unterstützen, reaggregieren Thymus Organkultur bleibt die einzige in-vitro-System in der Lage, effiziente MHC-Klasse-Support I und II-vermittelte Thymozyten Auswahl Veranstaltungen und so als ein wirksames Instrument zur Untersuchung verwendet werden kann die zelluläre und molekulare Regulation von positiven und negativen Selektion im Thymus.

Dieses Video zeigt die Zerlegung und Entfernung der fetalen Thymus sowie die Vorbereitung der ex vivo Kulturen von 2-dGuo behandelten Thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

Im Thymus ist bekannt, dass Interaktionen zwischen sich entwickelnden T-Zell-Vorläufern und Stromazellen, zu denen kortikale und medulläre Epithelzellen gehören, eine Rolle spielen ...

Hallo, ich bin Will Jenkinson aus der Arbeitsgruppe von Graham Anderson und Eric Jenkinson am MRC-Zentrum für Immunregulation der Universität Birmingham. Heute zeige ich Ihnen eine Technik zur Einrichtung von fetalen Thymusorgankulturen. Außerdem zeige ich Ihnen, wie man diese Organkulturen mit zwei Dioxazinen behandelt.Und dies ist eine Substanz, die in der Organkultur selektiv toxisch für lymphoide Zellen wirkt. Diese Technik findet im Labor mehrere Anwendungen. Eine davon ist die Herstellung von reaggregierten Organkulturen.Weitere Anwendungen umfassen die Untersuchung der verschiedenen Stadien der Zellentwicklung; mithilfe von fetalen Thymus-Organkulturen können wir Reagenzien hinzufügen, die entweder verschiedene Signalwege hemmen oder aktivieren, wodurch wir die Rolle spezifischer Moleküle in diesem Prozess untersuchen können. Beginnen wir also. Der erste Schritt bei der Herstellung von Thymus-Organkulturen besteht darin, Tag-14- oder Tag-15-Maus-Embryonen von ein bis zwei trächtigen Weibchen zu gewinnen.Zuerst den euthanasierten Mäuser mit 70 % Ethanol besprühen. Anschließend mit einer Pinzette das Fell anfassen und mit einer Schere im Bauchbereich einen V-förmigen Schnitt vornehmen, ausgehend von der Harnblase und entlang der beiden seitlichen Uterushörner nach oben fortsetzen. Das Uterushorn entfernen und in eine sterile 10 cm große Petrischale legen.Schneiden Sie entlang der Länge der Uteruswand und entfernen Sie die Embryonen, die sich noch in ihren Amnionhüllen befinden. Waschen Sie sie in einer Petrischale mit 10 ml PBS unter Verwendung von zwei Paar feiner Pinzetten. Öffnen Sie vorsichtig die Amnionhülle und lösen Sie den Embryo aus der Hülle und der Plazenta. Überführen Sie anschließend die Embryonen in eine frische Petrischale mit 10 Milliliter eines 50:50-Gemischs aus PBS und RPMI 1640, ergänzt mit 10 % FCS. Unter dem Stereomikroskop, wobei der Embryo in Medium eingetaucht bleibt, entfernen Sie den Kopf des Embryos mit einer Pinzette. Öffnen Sie die vordere Fläche der Brustwand, indem Sie die Spitzen eines geschlossenen Pinzettenpaares in die Brusthöhle einführen und dann die Pinzette öffnen, um die innere Brusthöhle freizulegen.Entfernen Sie den gesamten Brustkorb, Herz, Lungen, Luftröhre und Thymus, indem Sie vorsichtig unterhalb des Herzens anfassen, und legen Sie ihn in eine 35-Millimeter-Schale, die fünf Milliliter RPMI 1640 mit 10 % FCS enthält, von einem Embryo am Tag 14 bis 15. Die anfänglichen Thymuslappen befinden sich direkt oberhalb des Herzens auf beiden Seiten des Rumpfes hier.Entfernen Sie einzelne Thymuslappen mit feinen Pinzetten und entfernen Sie auch überschüssiges Bindegewebe sowie anhaftendes Blut, bevor Sie sie in die Organkultur überführen. Jetzt sind wir bereit für die Organkultur. Um eine lymphoide Detox herzustellen, nehmen Sie einen Thor-Neun-Millimolar-Stammlösung von zwei Dioxazin und bereiten 600 Mikroliter in einer 90-Millimeter-Bakterienkunststoff-Petri-Schale vor.Geben Sie vier Milliliter vorgewärmtes DMEM-Medium hinzu und schwenken Sie die Petrischale, sodass die gesamte Oberfläche mit dem Medium bedeckt ist. Selbstverständlich. Wenn Sie lymphoide Kulturen zur Untersuchung der T-Zell-Entwicklung anlegen möchten, lassen Sie die beiden Dioxazin-Stücke mit einer Pinzette heraus. Geben Sie zwei sterile Kunststoffüberzüge, auf einen Quadratzentimeter vorgeschnittene Schwämme, in die Schale.Lassen Sie das Medium etwa 30 Sekunden lang in den Schwamm einziehen. Drehen Sie dann den Schwamm um, um beide Seiten zu benetzen. Dadurch wird sichergestellt, dass das Medium in der Schale über den Gewebebereich gelangt, erneut unter Verwendung einer Pinzette.Platzieren Sie einen vorsterilisierten Nucleopore-Filter mit einer Porengröße von 0,8 Mikrometern auf die Oberfläche jedes Schwamms. Die Filter werden mit der glänzenden Seite nach oben auf die Schwammträger gelegt, um die Thymuslappen auf den Organkulturfilter zu übertragen. Wir bevorzugen eine Pasteur-Glaspipette, um Glaspipetten herzustellen. Erhitzen Sie das Glasrohr über einer Bunsenbrennerflamme, und sobald das Glas formbar ist, nehmen Sie das Glas von der Flamme und ziehen Sie an beiden Enden, um das Glas auf maximal 10 Zentimeter zu dehnen, und lassen Sie es anschließend abkühlen.Ziehen Sie dann an jedem Ende, um das Glas zu brechen. Dies erzeugt zwei kegelförmige Glaspipetten. Der dünne Bereich jeder Pipette ist etwa fünf Zentimeter lang und hat eine Spitze mit einem Durchmesser von etwa 0,5 Millimetern.Um die Pipettierapparatur einzurichten, setzen Sie eine Kunststoffpipettenspitze als Mundstück an das andere Ende und führen das stumpfe Ende einer Glaspipette in den Schlauch ein. Heben Sie einzelne Thymuslappen vorsichtig mit der Mundpipette auf und platzieren Sie sie auf der Oberfläche des 0,8-Mikrometer-Nitrocellulosefilters. Für die Organkultur empfehlen wir, fünf bis sechs Thymuslappen pro Filter zu platzieren, insgesamt also 10 bis 12 Thymuslappen pro Petrischale.Dies bietet ausreichend Platz für das Wachstum der Organ­kulturen und ermöglicht es den beiden Dioxazinen, alle endogenen lymphatischen Zellen zu eliminieren. Sobald die Kulturen eingerichtet sind, stellen Sie einen Sandwich­box­deckel mit dem Deckel einer 10 cm Petrischale als Plattform und doppelt destilliertem Wasser knapp unterhalb der Plattformhöhe her. Platzieren Sie bis zu drei Schalen in die Box und verschließen Sie den Deckel mit Klebeband. Der Deckel sollte zwei fünf Millimeter große Lufteinlassöffnungen in gegenüberliegenden Ecken aufweisen. Stellen Sie die Boxen nach der Herstellung für fünf bis sieben Tage in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator mit 10 % CO2, wonach wir die Kulturen disaggregieren und anschließend erneut aggregieren, um die Interaktionen zwischen stromalen und thymischen Zellen in einer kontrollierten dreidimensionalen Umgebung zu untersuchen. Nach einer Kultivierungsphase, die in der Regel fünf bis sieben Tage beträgt, werden F-Gespräche durch Eintauchen der Filter in Medium und vorsichtiges Abdrücken der Lappen mit einer Pinzette gewonnen. Wie Sie sehen können, sind lymphoide F-Tos in der Regel kleiner und zystisch im Vergleich zu nicht dioxazinbehandelten lymphatischen Lappen.Ich habe Ihnen soeben die Technik zur Einrichtung fetaler thymischer Organ­kulturen gezeigt. In diesem Protokoll haben wir Ihnen demonstriert, wie man die fetalen thymischen Organ­kulturen mit zwei Dioxazinen behandelt, wodurch nach typischerweise fünf bis sieben Tagen Kultivierung des Thymus alle lymphatischen Zellen eliminiert werden. Wir verwenden diese Organ­kulturen, um reaggregierte Organ­kulturen herzustellen.Dies ist jedoch nicht die einzige Technik. Wir verwenden außerdem nicht mit Dioxazin behandelte fetale thymische Organkulturen, die unter die Nierenkapsel von Thymus-Mäusen transplantiert werden. Zusätzlich nutzen wir lymphoide fetale thymische Organkulturen, um die T-Zell-Entwicklung unter kontrollierten Bedingungen in vitro zu untersuchen, frei von sekundären Effekten, die in vivo auftreten könnten.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video die Herstellung von 2-dGuo behandelten reaggregieren Thymus Kulturen demonstriert.

Reaggregieren Thymus Kulturen

Wir haben neuartige Labormethoden und Protokolle zur intravitale Bildgebung des Thymus entwickelt. Unsere Technik sollte bei der Identifizierung von „Nischen“ im Thymus helfen, in denen die Entwicklung von T-Zellen stattfindet.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Erzeugung funktioneller antigenspezifischer T-Zellen aus iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen unter Verwendung eines dreidimensionalen Thymuskultursystems. Die Co-Kultivierung der iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen mit endogenen lymphozytendepletierten Mäusen aus fetalen Thymuslappen führte zu einer erfolgreichen Reifung der T-Zellen zur Bildung von CD8αβ+ MHC-Klasse I+ iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten (iTEs).

Dreidimensionales Thymuskultursystem zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie.

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Wir bieten eine einfache und effiziente Methode, um 2'-Deoxyguanosin behandelt E18.5 Thymus in die Nierenkapsel einer Nacktmaus zu transplantieren. Diese Methode sollte bei der Untersuchung sowohl der Funktion der thymischen Epithelzellen als auch der Reifung von T-Zellen helfen.

Renale subkapsuläre Transplantation von 2'-Deoxyguanosin-behandeltem murineembryonenden Thymus bei nackten Mäusen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Bildung von humanen iPSC-abgeleiteten Thymus-Organoiden, die in 3D-Fibrin-Hydrogelen gezüchtet werden, um die Reifung der Thymusepithelzellen (TEC) und deren verlängerte Erhaltung sowie die Thymopoese in vitro zu unterstützen.

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Erfahren Sie die Herstellung von fetalen Thymus-Organkulturen mit 2-dGuo-Behandlung zur Untersuchung der T-Zell-Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die Analyse lymphoider Zellinteraktionen in vitro.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

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