Name: Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Lernen Sie Patch-Clamp-Recording von Ionenkanälen in Xenopus laevis-Oozyten. Diese Methode ermöglicht die Bildung von Gigaohm-Dichtungen und die Untersuchung von Zellmembranstrukturen für elektrophysiologische Studien.

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Schrumpfende Lösung Rezept stammt aus dem Labor von RW Aldrich. Wir danken folgenden Förderorganisationen und Stiftungen für die Unterstützung: National Institutes of Health, National Science Foundation, der American Heart Association, Gesellschaft für Muskeldystrophie, die Donald B. und Delia E. Baxter-Stiftung, die Klingenstein Fonds und der McKnight Endowment for Neuroscience.

Teil 1: Entfernen der Dotterhaut <ol><li> Bereiten Sie zwei Sätze von einer Pinzette. Wir bevorzugen Nr. 5 Pinzetten, wo ein Satz wurde leicht hat mit einer Feile geschärft. Auch bereiten ein Glas Transferpipette durch Trimmen und Feuerpolitur ein 7 &quot;Pasteurpipette. </li><li> Empfohlen: Um die Eizellen ein Verrutschen zu verhindern, schnitt einen Kreis von Raster (1 mm Quadrate) und Leim in den Boden einer 60mm-Petrischale. Dieses Gericht kann unbegrenzt wiederverwendet werden, wenn sauber zwischen den Anwendungen. </li><li> Füllen Sie die Petrischale zur Hälfte mit hyperosmotischen Lösung (siehe Rezept) und unter einem Binokular. </li><li> Nehmen Sie 1-3 Xenopus Oozyten aus ihrem Inkubationslösung mit einem polierten Pasteurpipette und Ort in die Schüssel. </li><li> Warten Sie 15s - 2 min für die Zellen beginnen zu schrumpfen. Längere Zeiten machen Zellen leichter zu schälen; kürzere Zeiten zu einem gesünderen Zellen für das Patchen führen. </li><li> Da die Zelle schrumpft, und die Dotterhaut beginnen zu kaum sichtbaren als transparente Schicht über der Zelle. Wählen Sie eine gesunde Zelle (ohne Wirbel oder Defekte) zum Schälen. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig greifen die Dotterhaut ohne Beschädigung der Plasmamembran. Bei den anderen, in der Nähe der gleichen Stelle zu erfassen und sanft reißen die klare Membran getrennt und frei von der Zelle. </li><li> Mit der Pasteurpipette vorsichtig bewegen die Zelle, um die Aufnahme Kammer. Beachten Sie, dass die Zelle wird nach vitelline Entfernung zerbrechlich. </li></ol> Teil 2: Gigaseal Generation <ol><li> Füllen Sie eine Aufzeichnung Pipette mit Kochsalzlösung. Verwenden Sie die minimale Volumen der Lösung, die guten elektrischen Kontakt mit dem Elektrodendraht um Pipette Kapazität zu minimieren. </li><li> Flick die Pipette mehrmals, damit entstehende Blasen schweben und auf die Elektrode Draht schieben. Druck auf die gefüllte Pipette. Dies kann durch den Mund oder mit einem Aquarium Pumpe aus einer Tierhandlung gemacht werden. Dieser Druck ist von entscheidender Bedeutung, damit die Pipette reinigt, da es die Flüssigkeit-Grenzfläche und bewegt sich in die Zelle durchquert. </li><li> Finden Sie die Eizelle in die Kammer und konzentrieren sich stark auf den Rand der Zelle. </li><li> Mit der Pipette aus der Badewanne, in der Mitte der (unscharf)-Spitze über die Zelle. Dies minimiert die Zeit in der Badewanne, bevor Dichtung Generation ausgegeben. </li><li> Löschen Sie die Pipette nach unten in scharfen Fokus neben der Zelle. Bringen Sie es in unmittelbarer Nähe (ca. 50 Mikrometer). Sie sollten eine kleine Verzerrung der Lösung gedrängt aus der Pipette durch den Gegendruck. </li><li> Mit dem Patch-Clamp-Software, überprüfen Sie den Widerstand der Pipette (unser Ziel ist es ca. 3-4 MOhm) und Null die aktuelle Verwendung der Spannungs-Offset. </li><li> Mit einem positiven Druck auf die Pipette, bewegen Sie die Spitze langsam in Richtung der Zelle während der Überwachung des Widerstandes visuell oder mit Hilfe einer Audio-Monitor, einen Ton, dessen Frequenz proportional zum Widerstand erzeugt. Als die Spitze beginnt, um die Zelle zu berühren, wird Widerstand zu erhöhen. </li><li> Plötzlich aber sanft von positiven Schalter Unterdruck von etwa den gleichen Betrag. Widerstand erhöhen sollte, um die Bildung zu versiegeln. </li><li> Die Mehrheit der Zeit, tritt Siegel Bildung innerhalb von wenigen Sekunden, gelegentlich 30-60 Sekunden benötigt. </li><li> Sobald der Widerstand bei 1GΩ, kann Druck auf neutral erscheinen. Sie haben nun eine On-Cell-Patch. Für eine inside-out patch, ziehen weg von der Zelle rasch. Für Außen-out, siehe unten. </li></ol> Teil 5: Outside-out-Topologie (optional) <ol><li> Unmittelbar nach Erreichen eines Gigaseal, Ruptur der Membran. Dies kann mit scharfen Saug getan werden, aber wir bevorzugen eine 1 V-Impuls für 1 ms. Der Widerstand sollte auf etwas mehr als die erste Pipette Widerstand fallen zu lassen. </li><li> Bewegen Sie die Pipette von der Zelle langsam und gleichmäßig. Sie sollten einen Teil der Zelle ziehen mit der Pipette. Plötzlich und innerhalb von wenigen Sekunden, wird die Zelle wieder einrasten und den Widerstand sollte sofort und gleichzeitig GΩs zurückzukehren. </li><li> Sie haben jetzt einen Patch in der outside-out-Konfiguration. Die Ektodomänen aller enthaltenen Ionenkanäle in das Bad ausgesetzt. </li></ol> Teil 6: Erwartete Ergebnisse Generell sind höhere Beständigkeit Dichtungen vorzuziehen und länger lebten. 10 GOhm ist ein guter Richtwert für hochwertige Dichtungen. In unserer Erfahrung, unterscheiden sich die Chancen auf Dichtungen von dieser Qualität mit vielen Faktoren, insbesondere Zell-und Pipette Qualität. Patch-Abtastraten können über 95% mit gesunden Zellen, saubere Pipetten und ein erfahrener Forscher sein. Diese Patches können für viele Minuten dauern und sind für jede elektrophysiologische Untersuchung von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert, darunter Einzel-Kanal-Aufnahmen geeignet.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

Es gibt viele Parameter elektrophysiologische Ableitung hier nicht diskutiert. Rig Setup, sind System-Management-Lärm-, Kanal-Ausdruck, und die Aufnahme Protokolle allem auch entscheidend für die gute experimentelle Ergebnisse. Nach unserer Erfahrung sind die wichtigsten Parameter für die Bildung zuverlässige Dichtungen: hochwertige Eizellen, die Beseitigung der Dotterhaut schnell (auch bekannt als &quot;Peeling&quot;), verwenden Sie neu gezogen Pipetten vor Staub geschützt, glatte Pipetten, positive Druck beim Betreten des Bades Lö...

<table><tbody><tr><td>Patch-Clamp-Verstärker &amp; Software</td><td>Instrument</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>Oder ein anderes ähnliches Gerät (z. B. HEKA EPC-9 oder Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>Pinzette Nr. 5 (zwei Paare)</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lösung zur Oozytenverkleinerung</td><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td>Zutaten In mM N-Methyl-D-glucamin 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Asparaginsäure 220 KCl 2 pH auf 7,4 mit N-Methyl-D-glucamin eingestellt</td></tr><tr><td>Gesponnener Mesh</td><td>800 µm</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp recording von ionenkanälen in xenopus oozyten exprimiert

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Seit der Entwicklung von Sakmann und Neher 1, 2, hat der Patch-Clamp zu einem etablierten und äußerst nützliche Technik für elektrophysiologische Messung von einzelnen oder mehreren Ionenkanälen in Zellen. Diese Technik kann auf Ionenkanäle sowohl in ihrer natürlichen Umgebung angewendet werden und ausgedrückt in heterologen Zellen, wie Eizellen aus dem Krallenfrosch, Xenopus laevis geerntet. Hier beschreiben wir die gut etablierte Technik der Patch-Clamp-Aufzeichnung von Xenopus Oozyten. Diese Technik wird verwendet, um die Eigenschaften ausgedrückt Ionenkanäle entweder messen in der Bevölkerung (macropatch) oder einzeln (Single-Channel-Aufnahme). Wir konzentrieren uns auf Techniken konzentrieren, die Qualität der Eizelle Vorbereitung und Dichtung Generation zu maximieren. Bei allen Faktoren optimiert, bietet diese Technik eine Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Abdichtung Generation über 90 Prozent. Der Prozess kann unterschiedlich von jedem Forscher auf die Faktoren, er oder sie findet wichtigste Basis optimiert werden, und wir stellen den Ansatz, die zu den größten Erfolg in unseren Händen haben.

Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Seit seiner Entwicklung durch Sakmann und Neher 1, 2 hat sich das Patch-Clamp als äußerst nützliche Technik für die elektrophysiologischen ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Entfernung der Vilin-Membran von Opus-Zellen, um erfolgreich die für Patch-Clamp-Aufzeichnungen notwendigen Gigaohm-widerstandsfähigen Dichtungen bilden zu können. Sobald die On-Cell-Patch-Clamp-Konfiguration erreicht wurde, kann Sog auf die Pipette ausgeübt werden, um elektrischen Zugang zum Zytoplasma der Zelle zu erhalten, was als Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration bekannt ist. Die Pipettenspitze kann dann von der Plasmamembran weggezogen werden, bis sie zurückschnellt, um ein kleines Membranareal zu erhalten, bei dem die ectodermalen Domänen der Kanäle der Badlösung ausgesetzt sind; dies ist als Outside-out-Patch-Konfiguration bekannt. Hallo, ich bin Austin Brown aus dem Labor von Dr. Miriam Goodman aus der Abteilung für Molekulare und Zelluläre Physiologie an der Stanford University.Und ich bin Brandon Johnson, ebenfalls aus dem Goodman-Labor. In einem vorherigen Video haben wir gezeigt, wie man Patch-Clamp-Pipetten und scharfe Elektroden für die Elektrophysiologie herstellt. Heute werden wir eine Einführung in die Patch-Clamp-Aufzeichnung von in zpa exprimierten Ionenkanälen präsentieren.Seit ihrer Entwicklung durch S. Sacramento und Air in de

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in...

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aktivität von K+-gegentransportierenden P-Typ-ATPasen durch heterologe Expression der Enzyme in Xenopus-Eizellen und Messung der Rb+- oder Li+-Aufnahme in einzelne Zellen mittels Atomabsorptionsspektrophotometrie. Die Methode ist eine empfindliche und sichere Alternative zu Radioisotopenflussexperimenten, die komplexe kinetische Studien ermöglicht.

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Die aufgeschnittenen Vaseline Lücke Ansatz werden geringe Geräuschaufnahmen von ionischen und Anschnittströme von spannungsabhängigen Ionenkanälen in Xenopus-Oozyten mit hoher Auflösung von schnellen Kanal Kinetik ausgedrückt zu erhalten. Mit geringen Modifikationen können Spannungsklemm Fluorometrie an den aufgeschnittenen Oozyte Protokoll gekoppelt werden.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen.

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

In diesem Artikel besprechen wir drei Gehirn-Präparate für die ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung die Retinotectal Schaltung von Xenopus Laevis Kaulquappen zu studieren. Jede Vorbereitung, mit ihren eigenen spezifischen Vorteilen, trägt zur experimentellen Lenkbarkeit des Xenopus Kaulquappe als Vorbild für neuronale Schaltkreis-Funktion zu untersuchen.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Gap-Junction-Proteine in Xenopus-Eizellen zu exprimieren und den Sperrschichtstrom zwischen zwei apponierten Eizellen mit einem kommerziellen Verstärker aufzuzeichnen, der für Dual-Eizellen-Spannungs-Clamp-Aufnahmen in einem hohen Seitenstrom-Messmodus entwickelt wurde.

Aufzeichnung des Gap-Junction-Stroms von Xenopus-Eizellen

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

Lernen Sie Patch-Clamp-Recording von Ionenkanälen in Xenopus laevis-Oozyten. Diese Methode ermöglicht die Bildung von Gigaohm-Dichtungen und die Untersuchung von Zellmembranstrukturen für elektrophysiologische Studien.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

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