Name: Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Spinalganglien-Neuronen in kompartimentierten Kulturen mit E15-Rattenembryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonaler Wachstumsprozesse und neuronaler Interaktionen in kontrollierten Umgebungen.

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Wir möchten Katharina Cosker und Stephanie Courchesne für hilfreiche Diskussionen danken.

Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Collagen-Beschichtung: Kollagen Mantel p35 Zellkulturplatten und in einem Ofen bei 37 ° C für 2 Tage vor dem Schmieren der Teiler. Die endgültige Konzentration von Kollagen sollten bei 0,71 mg / ml in .001 N HCl verdünnt werden. Dann fügen Sie 1 ml der Mischung pro Platte. </li><li> Fett Lader: Um das Fett loader zu füllen, eine 60 ml Spritze muss zunächst mit Corning Vakuum Fett gefüllt werden. Verwenden Sie die Spritze mit dem Fett-Loader zu füllen, wickeln Sie es in Folie und dann Autoklaven für 45 Minuten. </li><li> Teflon Teiler: die Teiler kann nach jedem Experiment wieder verwendet werden, sondern muss zuerst gründlich gereinigt werden. Entfernen Sie die Teiler von der Platte, wischen Sie alle verbleibenden Fett und in Schwefelsäure für 2 Tage. Nach dem Entfernen aus der Säure mit Wasser 3X, Kochen gründlich für 20 Minuten trocknen lassen, in ein Glas p100 Petrischale und Autoklaven für 20 Minuten. </li><li> N2-Methylcellulose: abwiegen 1,5 g Methylcellulose und legen Sie es in einer 500ml Flasche. Fügen Sie einen Rührstab und Autoklaven für 20 Minuten auf dem Trockenen (ab diesem Zeitpunkt alle Arbeiten müssen steril sein). Als Nächstes fügen Sie 500 ml serumfreiem Medium (N 2), und rühren Sie in einem kalten Raum, bis sie sich auflöst. Aliquot in 50 mL konische und Einfrieren bei -20 ° C. Für die Arbeit Lager, Aliquot einer der 50 mL konische in 1 ml Tuben und bei -20 ° C. </li><li> DRG-Medien: DMEM, 5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum und 1% Penicillin Streptomycin. </li><li> 100ng/mL DRGN Medien: Die Aktie Konzentration beider nerve growth factor (NGF) und brain-derived neurotrophen Faktor (BDNF) ist 1mg/ml. Verdünnen Sie jede der Neurotrophine 1:10.000 in den DRG-Medien. Kulturen können in NGF allein angebaut werden, dies ändert die Ergänzung von Neuronen, die in den Kulturen überleben. Hinweis: Bei Bedarf wird die Konzentration von (Cytosinarabinosid) AraC 1um und verwendet in einer Endkonzentration von 0.3uM. Dies hemmt das Wachstum von Schwann-Zellen und anderen Gliazellen. </li><li> 10ng/ml DRGN Medien: Verdünnen Sie die 100ng/mL DRGN Medien (1:10) mit DRG-Medien. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Abbildung 1" width="392" height="294"> Abbildung 1. Werkzeuge für die Set-up benötigt </li></ol> Einrichten des compartmented Kammern (Beginn dieses Prozesses 1-2 Tage vor der Dissektion) <ol><li> Machen Sie einen Kratzer in der Mitte eines Kollagen beschichtet p35 Schüssel mit einer passiven Bewegung. </li><li> Legen Sie 30ul der N2-Methylcellulose auf die Mitte des kratzen. Set Geschirr beiseite, bis Teiler ist gefettet. </li><li> Bringen Sie eine 23-Gauge-Luer-Steckadapter, um das Fett-Loader. Fassen Sie die Teflon Teiler mit einem Paar 90 °-Winkel Hämostatika und legen Sie es mit dem Teiler nach oben unter dem Mikroskop. Verfolgen Sie die Trennlinie mit Fett dafür sorgen, dass jedes Mal, wenn Sie den Adapter an einem neuen Ausgangspunkt der Adapter in das Fett aus dem vorherigen Schritt eingefügt wird so platziert, dass es eine kontinuierliche Reihe von Fett (siehe Diagramm). Sobald das Fett auf die gesamte Teiler angewendet wird, drehen Sie einen der vorbereiteten p35 Gerichte auf den Kopf und legen Sie sie so die N2-Methylcellulose ist über dem mittleren Fach. Drücken Sie auf den Boden der Schale mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, auf der Innenseite des Teilers in vier Ecken (oben links, unten rechts, oben rechts, unten links, im Diagramm durch "X" gekennzeichnet) drücken. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Abbildung 2" width="171" height="183"> Abbildung 2: Schritte zum Einfetten der Teiler Hinweis: Es ist wichtig, fest genug drücken, so dass das Fett eine vollständige Abdichtung mit dem Teller macht, aber wenn zu viel Druck hinzugefügt wird, die Axone nicht in die Seitentaschen überqueren. Nehmen Sie den Hämostatika, umdrehen und Ausspannen der Teiler. Schließlich legen Sie die Schale mit dem Teiler fest unter dem Mikroskop mit Schwerpunkt auf der Unterseite der mittleren Fach angebracht. Mit der Fett-Loader, machen Sie eine kleine Barriere (.25 cm), so dass, wenn die Zellen in der mittleren Fach gestellt werden können sie nicht auslaufen. </li><li> Nachdem mehrere Kulturen, Ort DRG Medien in jedem der seitlichen Fächern und in einen Inkubator, in dem die Zellen aufrechterhalten werden eingestellt. Lassen Sie den Kulturen für mehrere Stunden sitzen und prüfen Sie dann auf Dichtheit prüfen. Wenn das Medium in das mittlere Fach ausgelaufen sind, dann wird die Kultur unbrauchbar. Hinweis: Beim ersten Erlernen dieser Technik ist es wichtig, mehr Kulturen als für ein Experiment benötigt, da mehrere werden undicht. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Abbildung 3" width="254" height="191"> Abbildung 3: "Good vs leaky" Kultur </li></ol> Die Aufrechterhaltung DRG-Neuronen in compartmented Kulturen <ol><li> Tag 1: Ersetzen DRG Medien in den Seitentaschen mit 100ng/mL DRGN media + AraC. Führen Sie Dissektion und Zellen hinzufügen, um Fach-Center (100.000 Zellen). </li><li> Tag 2: Add 10ng/ml media + AraC auf der Außenseite des Teflon Teiler, bis die Medien fließt über die Fett-Schranke und der Austausch Flüssigkeit mit der Fach-Center. </li><li> Tag 3: Ersetzen Medien in den Seitentaschen zu 100ng/mL DRGN Weglassen des AraC und die Surround mit 10ng/ml DRGN Weglassen des AraC. </li><li> Tag 6: Ersetzen Medien in den Seitentaschen zu 1ng/mL + AraC und die Surround mit DRG media + AraC. </li><li> Tag 9: Verwenden Sie für Experimente. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Abbildung 4" width="267" height="148"> Abbildung 4: IHC Bilder Zellkörper und Axone distal Hinweis: Beim Wechsel der Medien, ist es wichtig, die Flüssigkeit aus der Spitze der einzelnen Seitenfach absaugen. Auch ändern sich nie die Medien aus dem mittleren Fach selbst, sondern nur aus den Surround, und lassen Sie es über die Fett-Schranke in das Zentrum fließen. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

In diesem Video haben wir gezeigt, wie man sich vorbereiten und pflegen compartmented Kammern für den Einsatz in Kultivierung DRG-Neuronen. Alles richtig, dieses System Trennung der Zellkörper aus dem Axon, um Mechanismen, durch die Neurotrophine Signal über lange Axone zu studieren. Da es fluidische Trennung zwischen den Fächern, ermöglicht es zur selektiven Stimulation oder Behandlung von einem Fach, ohne die anderen Fächer berührt wird. Compartmented Kammer Kulturen unterstützt auch andere Zelltypen, einschließlich sympathischen Neuronen...

<table><tbody><tr><td>Kollagen</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>N2-Methylcellulose 400CPS</td><td>Reagenz</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon-Trennwand</td><td>Sonstiges</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>viele andere Arten von Trennwänden sind erhältlich</td></tr><tr><td>Stiftrechen</td><td>Werkzeug</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>Fettapplikator</td><td>Werkzeug</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagenz</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Reagenz</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Haftfett für Hochvakuum</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Stutzenadapter, 23 Gauge</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>90&amp;#x00B0;-Winkel-Hämostat</td><td>Werkzeug</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

erstellung und pflege von spinalganglien neuronen in compartmented kulturen

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons verlängern axonalen Prozessen, die weit vom Zellkörper entfernt werden, um Zielgewebe, wo target-derived growth Faktoren für das neuronale Überleben und die Funktion erforderlich sind, innervieren. Neurotrophine sind speziell erforderlich, um das Überleben und die Differenzierung von innervieren sensorischen Neuronen zu halten, aber die Frage, wie diese Ziel-derived Neurotrophine zum Zellkörper der Neuronen innervieren zu kommunizieren, hat eine Fläche von aktiver Forschung seit über 30 Jahren. Die am häufigsten akzeptierte Modell, wie Neurotrophin-Signale erreichen den Zellkörper schlägt vor, dass Signalisierung tragen dieses Signal retrograd entlang des Axons Endosomen. Um retrograden Transport Studie wurde eine Kultur, das ursprünglich von Robert Campenot, in dem Zellkörper von ihrer Axone isoliert entwickelt. Die Technik zur Herstellung dieser compartmented Kammern zur Kultivierung von sensorischen Neuronen rekapituliert die selektive Stimulation von Neuronen Terminals, die in vivo nach der Entlassung von Soll-derived Neurotrophine auftritt. Retrograde Signal-Ereignisse, Langstrecken-Mikrotubuli abhängig retrograden Transport benötigen haben wichtige Implikationen für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.

Hier beschreiben wir die Technik der Herstellung und Aufrechterhaltung compartmented Kammern zur Kultivierung von sensorischen Neuronen der Spinalganglien.

Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

Neuronen bilden axonale Fortsätze aus, die weit vom Zellkörper entfernt sind, um Zielgewebe zu innervieren, wobei vom Zielgewebe stammende Wachstumsfaktoren erforderlich sind für ...

Dieses Verfahren beginnt damit, dass man mit einem Nadelkamm eine Kratzspur in die Mitte einer mit Kollagen beschichteten Platte macht und 30 Mikroliter Methylcellulose in die Mitte der Kratzspur pipettiert. Bestreichen Sie jeden Trennsteg mit Fett mithilfe einer Fettpatrone und befestigen Sie ihn an einer mit Kollagen beschichteten Platte. Geben Sie 100.000 Zellen aus E15-Rattenembryonen in das mittlere Kompartiment.Nach neun Tagen haben die Zellen Axone in das Seitenkompartiment ausgebildet und sind bereit für Experimente. Hallo, ich bin Maria Murphy aus dem Labor von Dr. Rosalyn Siegel in der Abteilung für pädiatrische Onkologie am Dana-Farber Cancer Institute. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung und Kultivierung von Dorsalwurzelganglien-Neuronen in kompartimentierten Kulturen.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Neurotrophin-Signalübertragung zu untersuchen. Beginnen wir also. Bevor die kompartimentierten Kammern eingerichtet werden, müssen P 35 Zellkulturschalen mit Kollagen beschichtet werden.Fügen Sie dazu ein Milliliter einer 0,71 Milligramm pro Milliliter Lösung von Kollagen in 0,001 normaler HCL zu den Platten hinzu und inkubieren Sie s

preparation-maintenance-dorsal-root-ganglia-neurons-compartmented

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG) aus Rattenembryonen und deren Co-Kultivierung mit Schwann-Zell-Vorläufern, um reife Schwann-Zellen zu erzeugen. Die isolierten DRGs werden verarbeitet, um Neuronen und Gliazellen zu isolieren. Die isolierten Zellen werden kultiviert, um die Neuronen zu reinigen, die dann mit Schwann-Zell-ähnlichen Zellen (SCLCs) in einem Co-Kulturmedium co-kultiviert werden. Die Interaktion mit den DRG-Neuronen führt...

Isolierung von DRG-Neuronen und Kokultur mit Schwann-Zell-Vorläufern zur Erzeugung von Schwann-Zellen

Dieses Video zeigt den Aufbau eines Zellkultursystems mit drei Kompartimenten unter Verwendung von Kollagen und nicht-reaktivem Fett. Dieses System wird verwendet, um Wechselwirkungen zwischen Gliomzellen und Axonen in Echtzeit zu beobachten.

Vorbereitung von kollagenbeschichteten Kompartiment-Kulturschalen für die neuronale Zellkultur

Das Video zeigt die Co-Kultivierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit Schwann-Zellen. DRG-Neuronen werden zunächst auf einer vorgedehnten Membran gezüchtet, um das Axonwachstum auszurichten. Dann werden Schwann-Zellen eingeführt, die sich an die Axone anheften, sie isolieren und das Überleben und die Funktion der Nervenzellen fördern.

Co-Kultur von Schwann-Zellen mit DRG-Neuronen auf einer vorgedehnten Membran

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Entnahme von Neuronen aus den dorsalen Wurzelganglien (DRG). DRG aus der Wirbelsäule einer Ratte wird isoliert, mit Enzymen behandelt und dann mechanisch dissoziiert, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Die Neuronen werden mittels Dichtegradientenzentrifugation von Gliazellen getrennt und in einem Wachstumsmedium kultiviert.

Eine Technik zur Gewinnung und Dissoziation von Spinalganglien für neuronale Kulturen

Dieses Video zeigt das Coculturing-Modell eines Explantats aus dem Spinalwurzelganglion und Schwann-Zellen. Unter Kokulturbedingungen fördert Ascorbinsäure die Differenzierung von Schwann-Zellen in myelinisierende Formen. Myelinisierende Schwann-Zellen umhüllen die Axone mehrmals, um eine Myelinscheide zu bilden, die für die Nervenfunktion unerlässlich ist.

Co-Kultivierung eines Explantats eines Spinalganglien-Explantats mit Schwann-Zellen für die Myelinisierung von Neuronen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von Zellen der dorsalen Wurzelganglien (DRG) aus der Wirbelsäule der Ratte. DRGs, die aus der Wirbelsäule herausgeschnitten werden, werden mit Enzymen behandelt und mechanisch dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen werden in einem Medium kultiviert, das Inhibitoren und Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von Gliazellen begrenzen bzw. das neuronale Wachstum fördern.

Etablierung einer primären Zellkultur der Spinalganglien der Dorsalwurzel aus einer Wirbelsäule der Ratte

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Dorsal Root Ganglien (DRG) Primärkulturen werden häufig verwendet, um physiologische Funktionen oder Pathologie-Veranstaltungen in sensorischen Neuronen zu studieren. Hier zeigen wir den Einsatz von lumbalen DRG-Kulturen, die Freisetzung von Neurotransmittern zu erkennen, nachdem Neuropeptid FF-Rezeptor Typ 2 Stimulation mit ein selektiver Agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Hier präsentieren wir ein ex-vivo gemischtes monolayer Kultursystem zur Erforschung der Migration menschlicher Gliomzellen (hGC) in Echtzeit. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen hGCs und myelinierten und nicht myelinierten Axonen innerhalb einer abgeteilten Kammer zu beobachten.

Echtzeit-Überwachung der Migration menschlicher Gliom-Zell auf Dorsalwurzel Ganglion Axon-Oligodendrozyten-Ko-Kulturen

Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Entnahme und Kultivierung von explantierten Spinalganglien (DRG) von adulten Sprague Dawley-Ratten in einem Multikompartiment-Gerät (MC).

Ernte, Einbettung und Kultivierung von dorsalen Wurzelganglien in Geräten mit mehreren Kompartimenten zur Untersuchung peripherer neuronaler Merkmale

Erfahren Sie die Kultivierung von Spinalganglien-Neuronen in kompartimentierten Kulturen mit E15-Rattenembryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonaler Wachstumsprozesse und neuronaler Interaktionen in kontrollierten Umgebungen.

Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

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