Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken
2. Februar 2009
Dieses Video zeigt whole mount Immunhistochemie, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster eines Antigens visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von Jane Dodd und Tom Jessell eingeführt.
Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte der Ganzpräparat-Immunhistochemie am Hühnerembryo unter Verwendung von HRP-konjugierten sekundären Antikörpern. Zunächst wird das Embryo in Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wird die endogene Peroxidase-Aktivität unterdrückt.
Das Embryo wird anschließend mit dem primären Antikörper inkubiert. Nach mehreren Waschschritten erfolgt die Inkubation des Embryos mit einem sekundären Antikörper, der mit HRP konjugiert ist. Die Farbreaktion wird unter Verwendung eines DAB-Substrats sichtbar gemacht, wobei die Antikörperfärbung orange erscheint. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der Verwendung fluoreszierender Antikörper liegt darin, dass die Embryos für die Einbettung in Paraffin aufbereitet werden können, wodurch die Untersuchung von Antigenlokalisationen im Querschnitt ermöglicht wird.
Hallo, ich bin Delphine aus dem Labor von FIN am Zentrum für Umwelt- und Genomische Medizin an der Texas A&M in Houston. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung von Immunfärbungen mit HRP-konjugierten Antikörpern an Wangenembryonen. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Morphologie von Embryonen nach Behandlung mit antiepileptischen Arzneimitteln zu untersuchen.
Beginnen wir nun mit der Durchführung der Immunhistochemie an ganzen Präparaten von Hühnerembryonen. Öffnen Sie zunächst ein Ei, indem Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf die Schale klopfen und Stücke der Schale entfernen. Entfernen Sie das dicke Eiweiß mit der Pinzette und kippen Sie die Eigelbmembran mit einer groben Pinzette, sodass sich der Embryo nach oben richtet.
Verwenden Sie anschließend feine Scheren, um ein quadratisches Stück der Dottersackmembran um das Embryo herum auszuschneiden. Entfernen Sie das Embryo vorsichtig mit einem Löffel vom Dottersack und legen Sie es in eine Schale, die PBS enthält, unter einem Dissektionsmikroskop. Entfernen Sie sorgfältig die Membranen im Dottersack und überführen Sie das Embryo in eine frische Schale mit PBS.
Nach dem Übertragen des Embryos den Embryo mit einer Pinzette und Insektnadeln fixieren und den PBS abpipettieren. Diesen durch 4 % PFA in PBS ersetzen und den Embryo eine Stunde bei Raumtemperatur fixieren, um potenzielle mikrobielle Kontaminationen zu minimieren. Verwenden Sie nach der Fixierung des Embryos für alle folgenden Schritte deionisiertes H2O, pipettieren Sie die Fixierlösung ab und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß als chemische Abfälle.
Füllen Sie die Petrischale mit BS. Schneiden Sie anschließend mit einem Mikrodissektionsmesser ein Quadrat um den Embryo herum, um die extraembryonalen Membranen zu entfernen. Entfernen Sie die Insektennadeln mit einer Pinzette, nachdem die Nadeln entfernt wurden. Verwenden Sie eine stumpfe Pasteurpipette, um den Embryo in ein Szintillationsfläschchen mit PBT zu überführen.
Waschen Sie das Embryo dreimal mit PBT, jeweils 10 Minuten lang. Entfernen Sie das PBT aus der Szintillationsflasche und ersetzen Sie es durch PBTX, das 0,3 % H₂O₂ enthält, um mögliche endogene Peroxidase zu inaktivieren. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Mutator.
Waschen Sie das Embryo zuerst dreimal mit PBT, jeweils 10 Minuten, dann dreimal jeweils 30 Minuten. Um das Embryo mit Antikörpern anzufärben, waschen Sie es zunächst eine Stunde lang im Blockierpuffer oder in 1 % BSA mit 1 % NGS.
Wir verwenden NGS, weil der sekundäre Antikörper in Ziege hergestellt wurde. Inkubieren Sie einen Tag nach der Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf Mutator, verdünnen den primären Antikörper im Verhältnis 1:1 in Blockierpuffer und inkubieren das Embryo zwei Tage lang bei vier Grad Celsius in dieser Lösung. Auf Mutator.
Der Verdünnungsfaktor des Primärantikörpers hängt von der Wahl des Primärantikörpers ab. Hier verwenden wir einen Antikörper aus der Entwicklungshybrid-DSH-Bank, der als Super natin bereitgestellt wird. Wir verdünnen ihn im Verhältnis 1:1 in Blockierpuffer.
Anschließend drei 10-minütige Waschungen in PBT sowie drei einstündige Waschungen in PBT durchführen. Nach dem Waschen das sekundäre Antikörper im Verhältnis 1 zu 2.500 in Blockierpuffer verdünnen. In diesem Fall peroxidasekonjugiertes Ziegen-Anti-US-IgG, und das Embryo über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Mutator inkubieren.
Führen Sie drei 10-minütige Waschungen in PBT gefolgt von drei einstündigen Waschungen in PBT durch, um die Farbreaktion des gefärbten Embryos zu entwickeln. Zuerst zwei 20-minütige Waschungen in Tris-Puffer (100 Millimolar Tris, HCl, pH 7,4). Entfernen Sie anschließend die letzte TS-Puffer-Waschung aus dem Röhrchen mit dem Embryo und ersetzen Sie sie durch fünf Milliliter DAB-Lösung.
Bewahren Sie es 20 Minuten lang im Dunkeln auf dem Mutator auf. Entsorgen Sie die Einmalpipettenspitze in dem Behälter mit einer 10 %igen Bleichmittel-Lösung. Um DAB zu dekontaminieren, fügen Sie 16 Mikroliter hinzu.
Gebe die H₂O₂-Stocklösung in das Gefäß mit den Embryonen in DAB. Bewahre es im Dunkeln auf. Nach 10 Minuten überwache die Reaktion unter dem Mikroskop, sobald die Farbreaktion abgeschlossen ist. Entsorge DAB im Bleichmittelbehälter und ersetze es durch fünf Milliliter.
Leitungswasser. Führen Sie danach zwei 10-minütige Waschungen in PBS durch, um die Probe für die Fotografie und Paraffinschnittpräparation vorzubereiten. Dehydrieren Sie das gefärbte Embryo in einer Ethanolreihe mit 25 %, 50 %, 75 % und 100 %, jeweils 10 Minuten lang.
Nach der Dehydrierung das Ethanol durch 0,5 bis ein Milliliter Zedernholzöl ersetzen. Dadurch wird das Embryo durchscheinend, was die Fotografie in Zedernholzöl ermöglicht. Nach der Fotografie das Embryo in das Gefäß zurückbringen und das Zedernholzöl durch 100 % Ethanol ersetzen.
Ersetzen Sie abschließend das Ethanol durch 5 % Fast Green FCF in 100 % Ethanol und inkubieren Sie drei Minuten lang. Dieser Schritt macht die Embryonen für die Histologie sichtbar. Ersetzen Sie die Fast-Green-FCF-Lösung durch 100 % Ethanol und bearbeiten Sie für die Histologie.
Hier sind drei Beispiele gefärbter Embryonen. Diese Embryonen des Stadions 11 sind mit 15,3 B neun markiert oder nicht. Ein Antikörper gegen das Nodalrohr, der im Labor von Jane Dod und Tom Gessel entwickelt wurde.
Nach zwei Minuten in DAB ist das Embryo noch transparent. Nach 20 Minuten in DAB erscheint eine schwache Färbung im Nodenstrang. Schließlich ist nach 40 Minuten die Färbung des Nodenstrangs vollständig.
In diesem Beispiel zeigen wir, wie PAC7, ein Antikörper aus dem Labor von Tom Jessel, frühe Stadien der Neuralrohrschlussbildung sowie die aus dem Mittelhirn hervortretenden kranialen Neuralleistenzellen erkennt. Hier wurde das Embryo mit der Croc20-Sonde aus dem Labor von David Wilkinson markiert und anschließend nicht mit einem Antikörper behandelt. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Immunhistochemie an Ganzpräparaten von Embryonen durchführt.
Dieses Verfahren kann auch an Embryonen angewendet werden, die zuvor für die In-situ-Hybridisierung im Ganzpräparat bearbeitet wurden. In diesem Fall fixieren Sie den Embryo kurz für eine Stunde nach der In-situ-Hybridisierung und fahren Sie anschließend mit der Antikörperfärbung fort. Das war's.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Video demonstriert die Immunhistochemie an Ganzpräparaten, eine Technik, die verwendet wird, um die räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster von Antigenen in jungen Hühnerembryonen sichtbar zu machen. Die Methode umfasst mehrere Schritte, einschließlich Fixierung und Inkubation mit Antikörpern, um die Färbungsergebnisse sichtbar zu machen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Die Ganzpräparat-Immunhistochemie ermöglicht die Untersuchung der Antigenverteilung in Embryonen.
- Diese Technik wurde ursprünglich von Jane Dodd und Tom Jessell eingeführt.
- Sie liefert Einblicke in Entwicklungsprozesse und Genexpression.
- HRP-konjugierte sekundäre Antikörper verbessern die Visualisierung von Antigenen.
Zweck der Studie
- Die Methode der Immunhistochemie an Ganzpräparaten demonstrieren.
- Die Antigenexpression in Hühnerembryonen sichtbar machen.
- Die Vorteile dieser Methode im Vergleich zu fluoreszenzbasierten Antikörpertechniken gegenüberstellen.
Verwendete Methoden
- Fixierung der Embryonen in Paraformaldehyd.
- Hemmung der endogenen Peroxidase-Aktivität.
- Inkubation in primären und sekundären Antikörpern.
- Farbreaktion mit DAB-Substrat zur Visualisierung.
Hauptergebnisse
- Die Antikörperfärbung erscheint orange und weist auf einen erfolgreichen Nachweis des Antigens hin.
- Embryonen können nach der Färbung für die Wachs-Schnitttechnik aufbereitet werden.
- Diese Methode ermöglicht Querschnittsuntersuchungen von Antigenlokalisationen.
- Verdeutlicht die Wirksamkeit von mit HRP konjugierten Antikörpern bei der Färbung.
Schlussfolgerungen
- Die Immunhistochemie an Ganzpräparaten ist eine wertvolle Technik zur Untersuchung von Hühnerembryonen.
- Sie ermöglicht eine klare Visualisierung der Expressionsmuster von Antigenen.
- Die Methode bietet Vorteile für anschließende histologische Analysen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Ganzpräparat-Immunhistochemie an Hühnerembryonen ermöglicht die räumliche Kartierung der Antigenexpression und unterstützt so die Zielstrukturvalidierung in der Entwicklungsneurowissenschaft. Die Methode trägt zur mechanistischen Entwicklungsrisikominderung bei, indem molekulare Zielstrukturen mit phänotypischen Ergebnissen in einem krankheitsrelevanten System verknüpft werden. Die Verträglichkeit mit Paraffinschnitten erlaubt es interdisziplinären Teams, immunhistochemische Daten mit histologischen Analysen zu korrelieren und verbessert dadurch die translationale Kohärenz bei der präklinischen Zielstrukturbewertung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Visualisierung der Antigenverteilung im sich entwickelnden Neuralrohr und Somit.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung des Target-Engagements in intakten Embryonen.
- Predictiver Wert: Steigert das Vertrauen in das Target, indem räumlich aufgelöste Expressionsdaten für die Leitstrukturidentifizierung bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Färbungsmuster unter Verwendung von HRP-konjugierten sekundären Antikörpern und DAB-Substrat.
- Quantitativer Output: Ermöglicht eine halbquantitative Beurteilung von Antigenstellen anhand der Farbintensität und unterstützt die Optimierung des Assays.
- Plattform-Wiederverwendung: Kompatibel mit Wachs-Schnitttechnik, wodurch dieselbe gefärbte Probe für mehrere nachgeschaltete analytische Workflows verwendet werden kann.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Anwendbar zur Untersuchung embryotoxischer Wirkungen von Substanzen, wie beispielsweise Antiepileptika, in einem Wirbeltiermodell.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem eine konsistente Antigenverfolgung in Ganzpräparaten und Schnittpräparaten ermöglicht wird.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Klärt, ob beobachtete Phänotypen mit einer Zielmodulation in sich entwickelnden Geweben korrelieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein und unterstützt frühe Stadien der Target-Validierung und der Assay-Entwicklung vor der Lead-Optimierung.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch Aufdeckung der räumlichen und zeitlichen Antigenexpression im sich entwickelnden Gehirn und Neuralrohr.
- Screening: Liefert standardisierte immunhistochemische Ergebnisse, die die reproduzierbare Bewertung von Substanzen in embryonalen Systemen unterstützen.
- Analytik: Erzeugt ein chromogenes Signal, das mittels Hellfeldmikroskopie nachweisbar ist, und ermöglicht so die quantitative Bildanalyse zum Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Biomarkerabstimmung, indem die Antigenlokalisation sowohl in Ganzpräparaten als auch in histologischen Schnitten validiert werden kann.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare histologiefähige Plattform dar, die in mehreren Projekten zur Untersuchung entwicklungstoxischer Effekte oder Zielstrukturexpression eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die Anwesenheit von Antigenen mit spezifischen embryonalen Strukturen verknüpft wird.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Fixierungs-, Blockierungs- und Antikörperinkubationsschritte.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch histologische Bestätigung der Zielmodulation.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf Profilen zur Bindung an entwicklungsrelevante Zielstrukturen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Embryodissektion, Immunhistochemie und chromogener Detektion.
- Setzt Zugang zu Mikroskopen, Mutatoren und Belüftung für die Handhabung von DAB und H2O2 voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Antikörperserien und Waschprotokollen zwischen den Teams.
- Die Anpassung an andere Arten kann eine Optimierung der Permeabilisierungs- und Blockierschritte erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören längere Inkubationszeiten und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Entsorgung von DAB, um Artefakte zu vermeiden.
