Protokoll zur Kultivierung sympathischen Neuronen aus Ratten-Superior Halsganglien (SCG)

Dieses Verfahren beginnt mit der Isolierung der oberen zervikalen sympathischen Ganglien von neugeborenen Ratten mit einem Alter von null Tagen. Jedes Gehirn besitzt zwei obere zervikale sympathische Ganglien. Aus einem einzigen Wurf von Jungtieren können etwa 24 Ganglien gewonnen werden.

Die Dissoziation der Ganglien beginnt mit Trips und einer Behandlungsdauer von 30 Minuten. Eine weitere Dissoziation erfolgt durch wiederholtes Pipettieren mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette, wodurch eine Einzelzell-Suspension entsteht. Die sympathischen Neurone werden anschließend auf mit Kollagen ENC beschichteten Schalen kultiviert.

Hallo, ich bin Nila Zurin aus dem Labor von Dr. Lloyd Green in der Abteilung für Pathologie und Zellbiologie an der Columbia University City. Heute werden wir demonstrieren, wie man primäre sympathische Neuronen aus den oberen Halsganglien neugeborener roter Welpen isoliert und kultiviert. In unserem Labor verwenden wir diese Zellen typischerweise, um die Apoptose als Reaktion auf den Entzug von Nervenwachstumsfaktor zu untersuchen.

Beginnen wir also. Wir starten das Verfahren, indem wir eine Kulturschale 24 Stunden vor der Durchführung der Dissektion mit Rattenschwanzkollagen beschichten. Je nach Art des Experiments wird eine 24-Loch- oder 48-Loch-Kulturplatte verwendet.

Als Nächstes werden Lösungen, Medium und Geräte vorbereitet. Diese Materialien und Reagenzien finden sich im schriftlichen Protokoll, das diesem Video beiliegt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Uridin- und 5-FDU-Lösung unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden müssen.

Setzen Sie die Herstellung mit dem Brenner fort. Polieren Sie die Glasmikropipetten für die Titrationschritte. Die Spitze der Glaspipette wird einige Sekunden lang unter Drehen in die Flamme gehalten, um sie einzuengen und zu glätten.

Die erste Feuerpolitur sollte in einer sterilen Zellkulturfume abgeführt werden. Um die Dissektion zu beginnen, sammeln Sie P-null- bis P-eins-neonatale Rattenwelpen. Ein neonataler Rattenwelpe wird schnell mit 70 % Ethanol abgewischt, um Kontaminationen zu reduzieren.

Nach der Enthauptung wird der Kopf mit der Bauchseite nach oben auf das Präparationspad gelegt, wobei das Kaudalende zu Ihnen zeigt. Die durchtrennte Luftröhre sollte leicht sichtbar sein. Sterile Spritzennadeln werden verwendet, um den abgetrennten Kopf auf folgende Weise am Präparationspad zu befestigen.

Stechen Sie eine Nadel durch das Gaumendach in die Unterlage und die zweite Nadel durch das durchtrennte Rückenmark in die Unterlage. Nachdem die Präparationsunterlage unter das Mikroskop geschoben und durch die Okulare geschaut wurde, verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um Haut und Fett rund um die Luftröhre zu entfernen. Dabei darauf achten, nicht zu tief einzugehen; ein Paar Muskeln, das fast parallel zueinander verläuft, wird beidseits der Luftröhre freigelegt.

Während der Dissektion müssen Sie mit kaltem sterilen PBS oder kaltem serumfreiem RPMI-1640-Medium, das mit einer sterilen Pasteurpipette zugegeben wird, spülen, um überschüssiges Blut zu entfernen. Dies kann einmal oder mehrmals erfolgen, abhängig davon, wie schnell man arbeitet. Anschließend werden die Pinzette verwendet, um zuerst die Muskulatur auf einer Seite zu durchtrennen und zu entfernen.

Nachdem der Muskel entfernt wurde, wird die Arteria carotis sichtbar. Diese Arterie verläuft entlang der Trachea und teilt sich in eine Y-förmige Schleife auf. Diese Aufzweigung stellt eine wichtige anatomische Markierung dar, und sobald sie lokalisiert ist, lässt sich das Ganglion cervicale superius relativ leicht finden.

Die Arterie wird am distalen Ende durchtrennt und mit der Pinzette leicht angehoben. Das andere Ende der Arterie bleibt angeheftet. Sobald dies erfolgt ist, wird das Ganglion cervicale superius sichtbar.

Man sollte erkennen, dass es sich um eine mandelförmige, glänzende, kleine Gewebemasse handelt, die locker an der Arterie an der Stelle der Aufzweigung befestigt ist, und dass sie fadenartige prä- und/oder postganglionäre Verbindungen aufweist. Ein zweites Paar Pinzetten wird verwendet, um das obere Halsganglion vorsichtig zu lösen und es in eine kleine 35-Millimeter-Kulturschale mit kaltem, serumfreiem RPMI-1640-Medium zu legen. Anschließend wird das Ganglion auf der anderen Seite der Luftröhre nach dem gleichen Protokoll entnommen.

Nachdem alle Ganglien herauspräpariert wurden, werden sie so weit wie möglich von überflüssigem Gewebe befreit. Unter dem Mikroskop ist zu erkennen, dass an den Ganglien anhaftende Stücke von Fettgewebe der Arteria carotis oder anderes Gewebe vorhanden sind; diese unerwünschten Bestandteile werden mit einer Pinzette entfernt. Die prä- und/oder postganglionären Verbindungsstränge werden ebenfalls abgetrennt.

Jedes Ganglion enthält etwa 10.000 Neuronen. Sobald die Neuronen ausplattiert sind, werden sie ihre Neuronen erneut ausbilden. Die Ganglien werden anschließend in ein steriles 15-Milliliter-Konischglas aus Polypropylen gegeben, das RPMI-1640-Medium enthält.

Anschließend wird die Kultur sympathischer Neuronen eingerichtet. Die Ganglien werden bei 200 G zwei Minuten lang zentrifugiert und das Überstand wird verworfen. Die Ganglien werden in 0,5 bis einem Milliliter einer 0,25 %igen Trypsinlösung resuspendiert und dann 30 Minuten lang in ein Wasserbad oder Inkubator bei 37 Grad Celsius gestellt, um die Dissoziation der Zellen in den Ganglien zu unterstützen.

Nach 30 Minuten werden 10 Milliliter komplettes Medium hinzugefügt, um die Trypsinlösung zu verdünnen und die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Anschließend werden die Lösungen bei 200 ×g für zwei Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dann verworfen und die Ganglien in zwei Milliliter Endmedium resuspendiert.

Unter Verwendung einer der vorbereiteten, feuerpolierten Pipettenspitzen mit weiter Öffnung werden die Zellen durch 20-maliges Auf- und Abpipettieren der Ganglien weiter dissoziiert. Anschließend wird das Röhrchen einige Minuten auf Eis gestellt. Danach wird die Pipette erneut feuerpoliert, um die Öffnung noch enger zu gestalten.

Nachdem die Pipette abgekühlt ist, werden die Ganglien weitere 20 Mal trituriert. Das Medium wird zunehmend trüber, was darauf hinweist, dass die Zellen dissoziiert werden. Dieser Schritt wird ein- oder zweimal wiederholt, je nachdem, wie gut die Zellen dissoziieren.

Nach einiger Zeit werden die Ganglien in Neuronen dissoziiert sein, und im Reagenzglas sind keine intakten Ganglien mehr sichtbar. Möglicherweise verbleibt etwas Gewebematerial, das zu diesem Zeitpunkt nicht dissoziiert. Das Reagenzglas wird einige Minuten auf Eis stehengelassen, damit sich nicht assoziierte Rückstände am Boden absetzen können.

Es wird vorsichtig das gesamte Überstandmedium bis auf etwa 50 Mikroliter abgenommen und in ein anderes Gefäß überführt. Die verbleibenden 50 Mikroliter verbleiben am Boden des Gefäßes, um eine Übertragung nicht assoziierten Materials zu verhindern. Weitere Menge des endgültigen Mediums wird dem Gefäß mit den dissoziierten Zellen hinzugefügt.

Das Volumen des hinzugefügten Endmediums hängt von der Art der Kulturplatte ab, die zur Kultivierung der Neuronen verwendet wird. Wenn beispielsweise eine 24-Well-Platte eingesetzt wird, dann eine Ganglien pro Well in 0,5 Milliliter Endmedium pro Well ansiedeln.

Ein typisches Rattenwurf besteht aus 12 Welpen, was 24 Ganglien ergibt. Dies reicht aus, um eine 24-Well-Platte zu besiedeln, und das Gesamtvolumen des Endmediums beträgt 12 Milliliter. Die Verwendung von Uridin-5-FDU im Endmedium verhindert die Proliferation und fördert den Tod einer kleinen Population von Gliazellen und anderen Zelltypen.

In der Kultur vorhandene Zellen werden alle 48 Stunden gefüttert, indem zwei Drittel des Mediums ersetzt werden. Mit frischem RPMI plus 1 % Pferdeserum plus NGF sowie Uridin und FDU. Anfangs enthält die Kultur sympathische Neuronen, die rundlich erscheinen und keine Neuriten aufweisen.

Kurze Neuronen werden 24 Stunden nach der Dissektion sichtbar und werden im Laufe der Zeit zunehmend dichter und stärker verzweigt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man primäre sympathische Neuronen aus den oberen Halsganglien neugeborener Rattentuben isoliert und kultiviert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und sorgfältig die Ganglien zu reinigen, indem man sämtliche Ablagerungen, Blutgefäße und Fettgewebe entfernt.

Dieser Schritt ist wichtig, um eine mehr oder weniger homogene Kultur zu gewährleisten, die frei von überflüssigen Zelltypen ist. Zweitens: Seien Sie während des Dissoziationsschritts geduldig und nehmen Sie sich die Zeit, die Neuronen voneinander zu trennen, damit sie nicht in großen Zellhaufen auftreten. Sobald sie in den Platten angesiedelt sind, erschweren große Zellhaufen die Weiterverarbeitung.

Bei nachgeschalteten Anwendungen wie dem Durchtrennen oder Infizieren der Neuronen kann auch die Immunfärbung beeinträchtigt sein, und jegliche Experimente, die eine Zählung der Neuronen erfordern, sind ebenfalls schwer durchführbar. Schließlich ist es nicht notwendig, das Medium mit Penicillin-Streptomycin zu supplementieren. Jedes Mal, wenn die Kulturen gefüttert werden, genügt es, Penicillin-Streptomycin nur beim ersten Mal hinzuzufügen, wenn die Zellen ausgeplattet werden.

Fügen Sie bei jedem Mediumwechsel frisches Uridin fünf FDU dem Medium hinzu. Unser Labor hat sympathische neuronale Kulturen verwendet, um die Apoptose als Reaktion auf den Entzug von Nervenwachstumsfaktor zu untersuchen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.