Name: Protokoll zur Kultivierung sympathischen Neuronen aus Ratten-Superior Halsganglien (SCG) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Lernen Sie die Isolation und Kultivierung primärer sympathischer Neuronen aus dem Superior Cervical Ganglion (SCG) von neugeborenen Ratten. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare in-vitro-Studien zur Neurobiologie.

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NZ möchte lab Mitglieder Subhas Biswas, Andrew Sproul und Ryan Willet für die Ausbildung ihrer in sezieren und Ernte sympathischen Neuronen zu danken. Unterstützt durch Zuschüsse aus dem NIH-NINDS.

1. Vorbereitung für die Zerlegung: <ol><li> Wählen Sie den entsprechenden Kulturschale (10 cm oder 6-well oder 24-Well-Platten, etc.) abhängig von der Art Ihrer Experimente und überziehen sie mit Rattenschwanz Collagen 24 Stunden vor dem Sezieren. Das Verfahren zur Herstellung von Rattenschwanz Collagen und dessen Verwendung zur Beschichtung von Kulturschalen wurden an anderer Stelle (1) beschrieben. </li><li> Bereiten Sie eine 0,25% Trypsin-Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (kein EDTA) und Filter zu sterilisieren. Bereiten Sie 1 ml aliquotiert und bei -20 º C. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung, die 2,5 mM jeweils von Uridin und 5-FDU in destilliertem / deionisiertem H 2 O. Filter-sterilisiert und bereiten 50 pl-Aliquots. Lagerung bei -20 º C. </li><li> Bereiten Sie komplette Medium: RPMI 1640 Kulturmedium mit 10% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum (Wärme durch Inkubation in einem 56 º C im Wasserbad für 30 Minuten inaktiviert) und 5% fötales Rinderserum. </li><li> Bereiten Finale Medium: RPMI 1640 Kulturmedium mit 1% hitzeinaktiviertem Pferdeserum + NGF (100ηg/ml Endkonzentration) + Penicillin / Streptomycin (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU-Lösung (10 nM Endkonzentration) . Hinweis: dieses Medium sollte nachgeholt werden frisch vor Gebrauch jedesmal. Für ein Experiment in einem 24-Well-Platten-Format, wird man brauchen, um 12 ml dieses Mediums vorbereitet. Es wird empfohlen, dass Sie ein wenig mehr Vorbereitung. NGF kann aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen (siehe Tabelle am Ende dieses Protokolls) erworben werden. </li><li> Ausstattung: Man wird einem Binokular und Lichtquelle benötigen. Ein Dual-Schwanenhals LWL-Hilfslicht mit Schwerpunkt Tipps bevorzugt. Darüber hinaus wird ein Bedarf zu reinigen und zu sterilisieren (durch Autoklavieren oder Eintauchen in 70% Ethanol für mindestens 20 Minuten) folgende Zerlegung-Werkzeuge: zwei Paare von Mikro-Sezieren Edelstahl Pinzette, und ein Paar Präparierscheren (auch aus Edelstahl und sowohl aus Roboz). Zwei sterile Injektionsnadeln (26 gague x 1 ½ Zoll oder ähnliches) wird auch benötigt werden. Es ist notwendig, eine Dissektion Bord, die eine 3 &quot;x3&quot; Stück Styropor in Aluminiumfolie eingewickelt und mit einem Kimwipe ist. Sprühen Sie die Karte mit 70% Ethanol zu dekontaminieren. Schließlich bereiten ein Feuer-poliertem Glas Weide Pipette. Um Feuer-Politur, nehmen Sie die Glaspipette und halten Sie die Spitze in die Flamme ein paar Sekunden, während der Rotation. Bei näherer Betrachtung wird die Spitze glatter aussehen und die Öffnung wird enger. Dies ist notwendig für den Schritt, wo die Zellen getrennt werden können. Führen Feuerpolitur in einer Zellkultur Haube, so dass die Pipette steril bleibt. </li></ol> 2. Dissection von Superior Halsganglien: <ol><li> Sammeln neugeborenen Ratten Welpen, die im Alter von P0 oder P1 sind. </li><li> Schnell wischen den Welpen für die Präparation mit 70% Ethanol, um die Chancen der Verschmutzung zu reduzieren. </li><li> Schnell enthaupten Welpe mit einem scharfen Schere (dieser Schritt wird nicht im Video angezeigt werden). Halten Sie den Kopf mit einer sterilen Pinzette gegen sterile Gaze kurz drain überschüssiges Blut. </li><li> Platzieren Sie den Kopf auf die Zerlegung Pad mit der Bauchseite nach oben und der kaudalen Ende orientierten Richtung. Der abgetrennte Luftröhre sollte gut sichtbar sein. Verwenden Sie die sterile Injektionsnadeln auf den abgetrennten Kopf der Sezieren Pad in der folgenden Weise zu sichern: push einen Pin obwohl das Dach des Mundes in die Polster und drücken Sie den zweiten Stift wenn der abgetrennte Luftröhre in die Polster. Platzieren Sie die Pads unter dem Binokular und beginnen Dissektion. </li><li> Mit beiden Pinzetten (eine in jeder Hand) wegzuräumen Haut und Fett um die Luftröhre, dabei nicht zu tief. Dadurch wird aussetzen ein Paar Muskeln laufen fast parallel zueinander auf beiden Seiten der Luftröhre. Hinweis: bei der Präparation, müssen Sie mit kaltem sterilem PBS oder kalt, serumfreien RPMI 1640-Medium mit einer sterilen, Pasteurpipette geliefert abzuwaschen überschüssiges Blut und zu halten, den Bereich sauber und feucht zu bewässern. Dies kann nur einmal oder mehrmals je nach getan werden, wie schnell man arbeitet. Für ein Erlebnis Dissektor, dauert es nur etwa zwei Minuten vor drei Minuten bis zu sezieren ein Paar Ganglien. </li><li> Verwenden Sie die Zange zu schneiden und entfernen Sie die Muskeln auf der einen Seite zuerst. </li><li> Sobald die Muskeln entfernt wird, wird die Halsschlagader sichtbar. Oft ist es hell rosa und enthält Blut. Es kann vorkommen, heller als andere Blutgefäße, dass Sie möglicherweise in der Nähe zu sehen und aus diesem Grund der Halsschlagader unter Umständen nicht sofort sichtbar. Diese Arterie verläuft entlang der Luftröhre und gabelt sich in das, was aussieht wie ein &quot;Y&quot;-förmigen Schleife. Diese Zweiteilung ist ein wichtiger Meilenstein und einmal er sich befindet, wird es relativ einfach, die SCG finden. </li><li> Sever die Arterie am meisten kaudalen Ende und heben Sie sie leicht mit der Zange (das andere Ende ist noch angeschlossen ist). Sobald Sie dies tun, werden Sie sehen, eine mandelförmige, glänzend aussehende kleine Masse von Gewebe, das lose an der Arterie ist nur zum Zeitpunkt der Bifurkation befestigt und das hat thread-wie Pre-und / oder postganglionären Verknüpfungen. Dies ist das Ganglion cervicale superius. Verwenden Sie eine zweite Zange in der anderen Hand vorsichtig heraus, und in einem kleinen Kulturschale (35 mm) mit kaltem, serumfreien RPMI 1640-Medium. </li><li> Anschließend entpacken Sie das Ganglion auf der anderen Seite der Luftröhre nach dem gleichen Protokoll. </li></ol> 3. Reinigung der Ganglia: <ol><li> Sobald alle Ganglien wurden herauspräpariert, sollten sie so viel wie möglich von fremden Gewebe befreit werden. </li><li> Unter dem Dissektionsmikroskop, können Sie sehen, dass die Ganglien haben Stücke von Arteria carotis, Fett oder anderes Gewebe angebracht. Arbeiten Sie mit einer Pinzette in jeder Hand zu necken sich diese unerwünschten Stoffe. Ort und Stelle gereinigt Ganglien in ein steriles 15 ml konische, Polypropylen-Röhrchen, mit RPMI 1640-Medium. </li><li> Die Vor-und / oder postganglionären Verknüpfungen sollten auch weggeschnitten werden. Jedes Ganglion hat etwa 10.000 Neuronen. Sobald die Neuronen vergoldet sind, werden sie wieder nachwachsen ihre Neuriten. </li></ol> 4. Gründung sympathische Neuron Kultur: <ol><li> Centrifuge die Ganglien an 200xg für 2 Minuten und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Ganglien in 0,5 bis 1 ml 0,25% Trypsin-Lösung. Legen Sie in einem 37 ˚ C Wasserbad oder Inkubator für 30 Minuten. Dies wird dazu beitragen distanzieren die Zellen in den Ganglien. </li><li> Nach 30 Minuten mit 10 ml Vollmedium zu verdünnen und zu neutralisieren die Trypsin und Zentrifuge bei 200xg für 2 Minuten. </li><li> Überstand und resuspendieren in 2 ml von Final Medium. </li><li> Weitere distanzieren die Zellen durch Zerreiben der Ganglien nach oben und unten mit dem Feuer-poliertem Glas Weide Pipette. Man reibt die Ganglien 20 Mal und legen Sie die Röhrchen auf Eis für ein paar Minuten. </li><li> In der Zwischenzeit, Feuer-polish der Pipette mehr, um die Öffnung schmaler (ca. 2 / 3 bis 1 / 2 mm im Durchmesser). Warten Sie ein paar Minuten, bis sie abkühlt und verreiben den Ganglien 20-mal mehr. Wie Sie fortfahren, wird das Medium geworden schrittweise trüber darauf hinweist, dass die Zellen werden dissoziiert. Wiederholen Sie diesen Schritt ein-oder zweimal, je nachdem wie gut die Zellen zu distanzieren. Nach einiger Zeit werden Sie feststellen, dass alle die Ganglien dissoziiert in Neuronen und keine intakten Ganglien sind sichtbar in die Röhre. Es kann einige Gewebe Material, das nicht distanzieren wird. An dieser Stelle lassen Sie die Röhre in Eis sitzen für ein paar Minuten so, dass jede undissoziierten Schutt auf dem Boden absetzen können. Jetzt sorgfältig sammeln fast alle des Mediums von oben und in einem anderen Rohr. Um sicherzustellen, dass Sie nicht sammeln die undissoziierten Schutt, verlassen etwa 50 ul am Boden des Röhrchens. Fügen Sie mehr von der Final Medium, um die Röhrchen mit dissoziierten Zellen: dieses Volumen ist abhängig von der Art der Kultur Platte ist man zur Kultur mit den Neuronen. Zum Beispiel: Wenn ein 24-well Schale eingesetzt werden, dann mit 0,5 Ganglien pro Well (~ 10.000 Neuronen pro Well) in 0,5 ml von Final Medium pro Vertiefung. Eine typische Ratte Wurf besteht aus 12 Welpen, die 24 Ganglien geben würde. Das ist genug, um Samen einer 24-Well-Platte und das Gesamtvolumen von Final Medium 12 ml. Hinweis: die Ganglien enthalten auch eine kleine Population von Gliazellen und anderen Zelltypen, die in der Kultur wird. Mit Uridine/5-FDU im Finale Medium verhindert ihre Verbreitung und Förderung ihres Todes. </li><li> Feed Zellen alle 48 Stunden durch den Austausch 2 / 3 des Mediums mit frischem RPMI +1% Pferdeserum + NGF und uridine/5-FDU. Hinweis: Auf den ersten, enthält die Kultur sympathischen Neuronen in dieser Runde ohne Neuriten zu suchen. Short Neuriten sichtbar 24 Stunden nach der Sektion und progressiv geworden dichter und im Laufe der Zeit verzweigt. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
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<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir verwenden Sprague Dawley Ratten für unsere Kulturen. Nehmen Sie sich Zeit und Sorgfalt bei der Reinigung der Ganglien. Entfernen Sie alle Fremdkörper, Blutgefäße und Fett. Dieser Schritt ist bei der Gewährleistung einer Kultur, die mehr oder weniger homogen und frei von fremden Zelltypen ist wichtig. Die Zugabe von uridine/5-FDU wird weitgehend beseitigt alle restlichen nicht-neuronalen (Mitose) Zellen Kontamination der Kultur oder zumindest zu unterdrücken ihre Verbreitung. Darüber hinaus, während die Dissoziation Schri...

<table><tbody><tr><td>Pinzette, Edelstahl #5</td><td>Werkzeug</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Schere, DEAVER gerade, scharf-stumpf – 43 mm Klingen – 5,5</td><td>Werkzeug</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit L-Glutamin</td><td>Reagenz</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Reagenz</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Spenderpferdeserum</td><td>Reagenz</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>Hitzeinaktivierung durch 30-minütiges Inkubieren im 56&amp;#x00B0;C-Wasserbad.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin ohne EDTA</td><td>Reagenz</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo;-deoxyuridin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagenz</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop und Lichtquelle</td><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Polypropylenröhrchen</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen</td><td>Werkzeug</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokoll zur kultivierung sympathischen neuronen aus ratten-superior halsganglien (scg)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Die überlegene Halsganglien (SCG) in Ratten sind klein, glänzend, mandelförmige Strukturen, die sympathischen Neuronen enthalten. Diese Neuronen liefern sympathischen Innervationen für die Kopf-Hals-Region, und sie stellen eine gut charakterisierte und relativ homogenen Bevölkerung (4). Sympathischen Neuronen sind abhängig von nerve growth factor (NGF) für das Überleben, Differenzierung und axonalen Wachstum und der weit verbreiteten Verfügbarkeit von NGF erleichtert, ihre Kultur und experimentelle Manipulation (2, 3, 6). Aus diesen Gründen haben kultivierten sympathischen Neuronen in einer Vielzahl von Studien, einschließlich der neuronalen Entwicklung und Differenzierung, die Mechanismen des programmierten und pathologischen Zelltod und Signaltransduktion (1, 2, 5 und 6) verwendet worden. Dissecting die SCG von neugeborenen Ratten und Kultivierung sympathischen Neuronen ist nicht sehr kompliziert und kann ziemlich schnell gemeistert werden. In diesem Artikel werden wir im Detail beschreiben, wie Sie sezieren die SCG von neugeborenen Ratten Welpen und sie zu nutzen, um Kulturen von sympathischen Neuronen zu etablieren. Der Artikel beschreibt auch die vorbereitenden Schritte und die verschiedenen Reagenzien und Geräte, die benötigt wird, um dies zu erreichen sind.

Dies ist ein Protokoll beschreibt, wie zu isolieren und Kultur primären sympathischen Neuronen aus überlegen Halsganglien (SCG) der neugeborenen Ratte Welpen.

Protokoll zur Kultivierung sympathischen Neuronen aus Ratten-Superior Halsganglien (SCG)

Die Ganglia cervicalia superioria (SCG) bei Ratten sind kleine, glänzende, mandelförmige Strukturen, die sympathische Neuronen enthalten. Diese Neuronen stellen ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Isolierung der oberen zervikalen sympathischen Ganglien von neugeborenen Ratten mit einem Alter von null Tagen. Jedes Gehirn besitzt zwei obere zervikale sympathische Ganglien. Aus einem einzigen Wurf von Jungtieren können etwa 24 Ganglien gewonnen werden.Die Dissoziation der Ganglien beginnt mit Trips und einer Behandlungsdauer von 30 Minuten. Eine weitere Dissoziation erfolgt durch wiederholtes Pipettieren mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette, wodurch eine Einzelzell-Suspension entsteht. Die sympathischen Neurone werden anschließend auf mit Kollagen ENC beschichteten Schalen kultiviert.Hallo, ich bin Nila Zurin aus dem Labor von Dr. Lloyd Green in der Abteilung für Pathologie und Zellbiologie an der Columbia University City. Heute werden wir demonstrieren, wie man primäre sympathische Neuronen aus den oberen Halsganglien neugeborener roter Welpen isoliert und kultiviert. In unserem Labor verwenden wir diese Zellen typischerweise, um die Apoptose als Reaktion auf den Entzug von Nervenwachstumsfaktor zu untersuchen.Beginnen wir also. Wir starten das Verfahren, indem wir eine Kulturschale 24 Stunden vor der Durchführung der Dissektion mit Rattenschwanzkollagen beschichten. Je nach Art des Experiments wird eine 24-Loch- oder 48-Loch-Kulturplatte verwendet.Als Nächstes werden Lösungen, Medium und Geräte vorbereitet. Diese Materialien und Reagenzien finden sich im schriftlichen Protokoll, das diesem Video beiliegt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Uridin- und 5-FDU-Lösung unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden müssen.Setzen Sie die Herstellung mit dem Brenner fort. Polieren Sie die Glasmikropipetten für die Titrationschritte. Die Spitze der Glaspipette wird einige Sekunden lang unter Drehen in die Flamme gehalten, um sie einzuengen und zu glätten.Die erste Feuerpolitur sollte in einer sterilen Zellkulturfume abgeführt werden. Um die Dissektion zu beginnen, sammeln Sie P-null- bis P-eins-neonatale Rattenwelpen. Ein neonataler Rattenwelpe wird schnell mit 70 % Ethanol abgewischt, um Kontaminationen zu reduzieren.Nach der Enthauptung wird der Kopf mit der Bauchseite nach oben auf das Präparationspad gelegt, wobei das Kaudalende zu Ihnen zeigt. Die durchtrennte Luftröhre sollte leicht sichtbar sein. Sterile Spritzennadeln werden verwendet, um den abgetrennten Kopf auf folgende Weise am Präparationspad zu befestigen.Stechen Sie eine Nadel durch das Gaumendach in die Unterlage und die zweite Nadel durch das durchtrennte Rückenmark in die Unterlage. Nachdem die Präparationsunterlage unter das Mikroskop geschoben und durch die Okulare geschaut wurde, verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um Haut und Fett rund um die Luftröhre zu entfernen. Dabei darauf achten, nicht zu tief einzugehen; ein Paar Muskeln, das fast parallel zueinander verläuft, wird beidseits der Luftröhre freigelegt.Während der Dissektion müssen Sie mit kaltem sterilen PBS oder kaltem serumfreiem RPMI-1640-Medium, das mit einer sterilen Pasteurpipette zugegeben wird, spülen, um überschüssiges Blut zu entfernen. Dies kann einmal oder mehrmals erfolgen, abhängig davon, wie schnell man arbeitet. Anschließend werden die Pinzette verwendet, um zuerst die Muskulatur auf einer Seite zu durchtrennen und zu entfernen.Nachdem der Muskel entfernt wurde, wird die Arteria carotis sichtbar. Diese Arterie verläuft entlang der Trachea und teilt sich in eine Y-förmige Schleife auf. Diese Aufzweigung stellt eine wichtige anatomische Markierung dar, und sobald sie lokalisiert ist, lässt sich das Ganglion cervicale superius relativ leicht finden.Die Arterie wird am distalen Ende durchtrennt und mit der Pinzette leicht angehoben. Das andere Ende der Arterie bleibt angeheftet. Sobald dies erfolgt ist, wird das Ganglion cervicale superius sichtbar.Man sollte erkennen, dass es sich um eine mandelförmige, glänzende, kleine Gewebemasse handelt, die locker an der Arterie an der Stelle der Aufzweigung befestigt ist, und dass sie fadenartige prä- und/oder postganglionäre Verbindungen aufweist. Ein zweites Paar Pinzetten wird verwendet, um das obere Halsganglion vorsichtig zu lösen und es in eine kleine 35-Millimeter-Kulturschale mit kaltem, serumfreiem RPMI-1640-Medium zu legen. Anschließend wird das Ganglion auf der anderen Seite der Luftröhre nach dem gleichen Protokoll entnommen.Nachdem alle Ganglien herauspräpariert wurden, werden sie so weit wie möglich von überflüssigem Gewebe befreit. Unter dem Mikroskop ist zu erkennen, dass an den Ganglien anhaftende Stücke von Fettgewebe der Arteria carotis oder anderes Gewebe vorhanden sind; diese unerwünschten Bestandteile werden mit einer Pinzette entfernt. Die prä- und/oder postganglionären Verbindungsstränge werden ebenfalls abgetrennt.Jedes Ganglion enthält etwa 10.000 Neuronen. Sobald die Neuronen ausplattiert sind, werden sie ihre Neuronen erneut ausbilden. Die Ganglien werden anschließend in ein steriles 15-Milliliter-Konischglas aus Polypropylen gegeben, das RPMI-1640-Medium enthält.Anschließend wird die Kultur sympathischer Neuronen eingerichtet. Die Ganglien werden bei 200 G zwei Minuten lang zentrifugiert und das Überstand wird verworfen. Die Ganglien werden in 0,5 bis einem Milliliter einer 0,25 %igen Trypsinlösung resuspendiert und dann 30 Minuten lang in ein Wasserbad oder Inkubator bei 37 Grad Celsius gestellt, um die Dissoziation der Zellen in den Ganglien zu unterstützen.Nach 30 Minuten werden 10 Milliliter komplettes Medium hinzugefügt, um die Trypsinlösung zu verdünnen und die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Anschließend werden die Lösungen bei 200 ×g für zwei Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dann verworfen und die Ganglien in zwei Milliliter Endmedium resuspendiert.Unter Verwendung einer der vorbereiteten, feuerpolierten Pipettenspitzen mit weiter Öffnung werden die Zellen durch 20-maliges Auf- und Abpipettieren der Ganglien weiter dissoziiert. Anschließend wird das Röhrchen einige Minuten auf Eis gestellt. Danach wird die Pipette erneut feuerpoliert, um die Öffnung noch enger zu gestalten.Nachdem die Pipette abgekühlt ist, werden die Ganglien weitere 20 Mal trituriert. Das Medium wird zunehmend trüber, was darauf hinweist, dass die Zellen dissoziiert werden. Dieser Schritt wird ein- oder zweimal wiederholt, je nachdem, wie gut die Zellen dissoziieren.Nach einiger Zeit werden die Ganglien in Neuronen dissoziiert sein, und im Reagenzglas sind keine intakten Ganglien mehr sichtbar. Möglicherweise verbleibt etwas Gewebematerial, das zu diesem Zeitpunkt nicht dissoziiert. Das Reagenzglas wird einige Minuten auf Eis stehengelassen, damit sich nicht assoziierte Rückstände am Boden absetzen können.Es wird vorsichtig das gesamte Überstandmedium bis auf etwa 50 Mikroliter abgenommen und in ein anderes Gefäß überführt. Die verbleibenden 50 Mikroliter verbleiben am Boden des Gefäßes, um eine Übertragung nicht assoziierten Materials zu verhindern. Weitere Menge des endgültigen Mediums wird dem Gefäß mit den dissoziierten Zellen hinzugefügt.Das Volumen des hinzugefügten Endmediums hängt von der Art der Kulturplatte ab, die zur Kultivierung der Neuronen verwendet wird. Wenn beispielsweise eine 24-Well-Platte eingesetzt wird, dann eine Ganglien pro Well in 0,5 Milliliter Endmedium pro Well ansiedeln.Ein typisches Rattenwurf besteht aus 12 Welpen, was 24 Ganglien ergibt. Dies reicht aus, um eine 24-Well-Platte zu besiedeln, und das Gesamtvolumen des Endmediums beträgt 12 Milliliter. Die Verwendung von Uridin-5-FDU im Endmedium verhindert die Proliferation und fördert den Tod einer kleinen Population von Gliazellen und anderen Zelltypen. In der Kultur vorhandene Zellen werden alle 48 Stunden gefüttert, indem zwei Drittel des Mediums ersetzt werden. Mit frischem RPMI plus 1 % Pferdeserum plus NGF sowie Uridin und FDU. Anfangs enthält die Kultur sympathische Neuronen, die rundlich erscheinen und keine Neuriten aufweisen.Kurze Neuronen werden 24 Stunden nach der Dissektion sichtbar und werden im Laufe der Zeit zunehmend dichter und stärker verzweigt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man primäre sympathische Neuronen aus den oberen Halsganglien neugeborener Rattentuben isoliert und kultiviert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und sorgfältig die Ganglien zu reinigen, indem man sämtliche Ablagerungen, Blutgefäße und Fettgewebe entfernt.Dieser Schritt ist wichtig, um eine mehr oder weniger homogene Kultur zu gewährleisten, die frei von überflüssigen Zelltypen ist. Zweitens: Seien Sie während des Dissoziationsschritts geduldig und nehmen Sie sich die Zeit, die Neuronen voneinander zu trennen, damit sie nicht in großen Zellhaufen auftreten. Sobald sie in den Platten angesiedelt sind, erschweren große Zellhaufen die Weiterverarbeitung.Bei nachgeschalteten Anwendungen wie dem Durchtrennen oder Infizieren der Neuronen kann auch die Immunfärbung beeinträchtigt sein, und jegliche Experimente, die eine Zählung der Neuronen erfordern, sind ebenfalls schwer durchführbar. Schließlich ist es nicht notwendig, das Medium mit Penicillin-Streptomycin zu supplementieren. Jedes Mal, wenn die Kulturen gefüttert werden, genügt es, Penicillin-Streptomycin nur beim ersten Mal hinzuzufügen, wenn die Zellen ausgeplattet werden.Fügen Sie bei jedem Mediumwechsel frisches Uridin fünf FDU dem Medium hinzu. Unser Labor hat sympathische neuronale Kulturen verwendet, um die Apoptose als Reaktion auf den Entzug von Nervenwachstumsfaktor zu untersuchen. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben ein Protokoll für die Verwendung Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder Matrigel, um selektiv zu induzieren dendritisches Wachstum in Original-sympathischen Neuronen dissoziiert von der oberen Halsganglien (SCG) der perinatalen Ratten.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

Das Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Modellsystem zur Untersuchung Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Latenz und Reaktivierung. Der Test verwendet homogene sympathischen Neuronen Kulturen und ermöglicht die molekulare Analyse der Virus-Neuron-Wechselwirkungen unter Verwendung einer Vielzahl von Anwendungen, wie RNA-Interferenz und Expression von rekombinanten Proteinen.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG) aus Rattenembryonen und deren Co-Kultivierung mit Schwann-Zell-Vorläufern, um reife Schwann-Zellen zu erzeugen. Die isolierten DRGs werden verarbeitet, um Neuronen und Gliazellen zu isolieren. Die isolierten Zellen werden kultiviert, um die Neuronen zu reinigen, die dann mit Schwann-Zell-ähnlichen Zellen (SCLCs) in einem Co-Kulturmedium co-kultiviert werden. Die Interaktion mit den DRG-Neuronen führt...

Isolierung von DRG-Neuronen und Kokultur mit Schwann-Zell-Vorläufern zur Erzeugung von Schwann-Zellen

Dieses Video zeigt die Isolierung und Kultivierung von Schwann-Zellen aus den Spinalwurzeln der Maus. Isolierte Zellen werden dann in speziellen Medien kultiviert. Schwann-Zellen werden über differentiellen Verdau und Adhärenz isoliert. Anschließend werden sie zur Befestigung und Proliferation auf mit extrazellulärer Matrix beschichtete Deckgläser übertragen.

Isolierung von Schwann-Zellen aus spinalen Wurzeln der Maus

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von Zellen der dorsalen Wurzelganglien (DRG) aus der Wirbelsäule der Ratte. DRGs, die aus der Wirbelsäule herausgeschnitten werden, werden mit Enzymen behandelt und mechanisch dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen werden in einem Medium kultiviert, das Inhibitoren und Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von Gliazellen begrenzen bzw. das neuronale Wachstum fördern.

Etablierung einer primären Zellkultur der Spinalganglien der Dorsalwurzel aus einer Wirbelsäule der Ratte

Hier beschreiben wir eine Schwann-Zellen (SC) Migration Assay, in dem SCs sind in der Lage zu entwickeln entlang erstreckt Axone.

Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Dorsal Root Ganglien (DRG) Primärkulturen werden häufig verwendet, um physiologische Funktionen oder Pathologie-Veranstaltungen in sensorischen Neuronen zu studieren. Hier zeigen wir den Einsatz von lumbalen DRG-Kulturen, die Freisetzung von Neurotransmittern zu erkennen, nachdem Neuropeptid FF-Rezeptor Typ 2 Stimulation mit ein selektiver Agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dieses Papier beschreibt die Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten sympathischen Neuronen aus den überlegenen zervikalen Ganglien. Es bietet auch detaillierte Protokolle für immunzytochemische Färbung und für die Vorbereitung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie-Analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen aus embryonalen überlegenen Cervical Ganglia für morphologische und proteomische Analyse

Küken-Ziliarganglien (CG) sind Teil des parasympathischen Nervensystems. Neuronale Kulturen von Küken CG Neuronen wurden gezeigt, dass effektive Zellmodelle in der Studie der Nervenmuskel-Interaktionen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von CG-Neuronen aus Kükenembryonen.

Isolation und Kultur von Chick Ciliary Ganglion Neurons

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Ablation der adrenergen Innervation durch Identifizierung und Resektion des Ganglion cervicalis superior.

Operationstechnik für die überlegene zervikale Ganglionektomie im Mausmodell

Lernen Sie die Isolation und Kultivierung primärer sympathischer Neuronen aus dem Superior Cervical Ganglion (SCG) von neugeborenen Ratten. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare in-vitro-Studien zur Neurobiologie.

Protokoll zur Kultivierung sympathischen Neuronen aus Ratten-Superior Halsganglien (SCG)

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