Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen

Dieses Verfahren beginnt mit der Entfernung des Kleinhirns von P vier bis P fünf. Bei neugeborenen Mäusen werden die Hirnhäute und der Plexus choroideus von einzelnen Kleinhirnen entfernt, die anschließend in einem 15-Milliliter-Konischgefäß gesammelt werden. Die Kleinhirne werden mit Papain dissociiert und durch sanftes Schütteln in eine Einzelzell-Suspension überführt.

Diese Suspension wird durch ein Nylon-Netz mit einer Porengröße von 70 Mikron per Schwerkraft filtriert. Der Durchfluss wird vorsichtig auf einen diskontinuierlichen Percoll-Gradienten aufgeschichtet und zentrifugiert, um die Granulazellen von den Gliazellen in Neuronen und Perkin-Gen-Neuronen zu trennen. Die Zellen an der Grenzfläche des Gradienten werden gesammelt und vorab auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Platten ausplattiert.

Um die Gliazellen weiter zu entfernen, werden Granulazellen gesammelt, gezählt und in gewünschten Dichten auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Glas-Objektträgern oder Kunststoffkulturschalen ausgesät. Hallo, ich bin Hey Young Lee aus dem Labor von Dr. Lloyd Green in der Abteilung für Pathologie an der Columbia University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von zerebellären Granulaneuronen aus postnatalen Mäusen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Proliferation und Differenzierung von Granularganglienzell-Vorläufern zu untersuchen. Beginnen wir also. Dieses Verfahren beginnt damit, dass man 70 %igen Ethanol im Präparationsbereich verwendet, um zerebelläre Granulazellen zu dissoziieren; wir verwenden das Papin-Dissoziationssystem.

Wenn Sie ein neues Kit beginnen, bereiten Sie die Albumin-OVO-äquivalente MOID-Hemmlösung vor. Nehmen Sie dazu 32 Milliliter der im Kit enthaltenen Earl’schen Pufferlösung (EBSS) und geben Sie diese zur Albumin-OVO-Moid-Mischung hinzu. Stellen Sie die Lösung beiseite, während Sie die anderen Bestandteile vorbereiten, damit sich der Inhalt auflösen kann.

Als Nächstes fünf Milliliter EBSS zu einem Papain-Röhrchen aus dem Dissoziationskit hinzufügen. Jedes Röhrchen reicht zur Dissoziation von vier bis 15 Kleinhirnen von P5-Mäusen. Anschließend das Papain-Röhrchen für fünf bis 10 Minuten in einen Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 Grad Celsius stellen, bis das Papain vollständig gelöst ist und die Lösung klar erscheint.

Halten Sie die Lösung während der Dissektion bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 500 µL EBSS in das 1D-NAS-Röhrchen aus dem Kit. Mischen Sie vorsichtig durch leichtes Antippen des Röhrchens.

Da DNAS empfindlich gegenüber Scherdenaturierung ist, geben Sie 250 Mikroliter dieser Lösung zu dem Röhrchen mit Pepane, um eine Endkonzentration von 20 Einheiten pro Milliliter und 0,005 % DNA zu erhalten; bewahren Sie die verbleibende DNA-Datei für die Verwendung in späteren Schritten auf. Sobald die Werkzeuge und Reagenzien bereitstehen, fahren Sie mit der Dissektion der Kleinhirne und der Entfernung der Hirnhäute für dieses Verfahren fort. C57 Black Six Mäuse werden zwischen den postnatalen Tagen vier und sechs verwendet.

Dieser Altersbereich ist optimal für die Kultur von Granulazellen, da die Anzahl der Vorläuferzellen der äußeren Granularschicht oder EGL-Granulazellen ein Maximum erreicht hat. Pipettieren Sie 15 Milliliter HBSS-Glukose in eine 60 Millimeter große Kunststoffkulturschale und 10 Milliliter in ein steriles kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis, wischen Sie den Kopf des Welpen mit 70 %igem Ethanol ab und entfernen Sie den Kopf mit einer Schere.

Überführen Sie den Kopf in den Abzug und halten Sie ihn mit einer Pinzette so, dass die Hinterseite des Schädels deutlich sichtbar ist. Führen Sie die mikrochirurgische Schere in das Foramen magnum ein, um Zugang zum Gehirn zu erhalten, und schneiden Sie dann gerade in Richtung der Augen. Verwenden Sie eine feine Dumont-Pinzette.

Schritt fünf: Mit einer Pinzette die Haut abziehen und den Schädel anheben, um das Gehirn freizulegen. Dann das Kleinhirn und das umgebende Mittelhirn abquetschen. In die Schale mit HBSS-Glukose überführen.

Beachten Sie, dass es einfacher ist, das Kleinhirn zu manipulieren und die Hirnhäute zu entfernen, wenn das Kleinhirn noch mit dem umgebenden Gewebe verbunden ist. Legen Sie das Gewebe anschließend unter ein Stereomikroskop. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Kleinhirn auf der Unterlage festzuhalten.

Verwenden Sie feine Dumont-Nummer-fünf-Forceps, um die Hirnhäute vorsichtig vom Kleinhirn sowie zwischen den Lappen zu lösen. Sie werden Blutgefäße auf der Oberfläche des Kleinhirns bemerken.

Diese Blutgefäße eignen sich gut zur Identifizierung der Hirnhäute. Setzen Sie die Entfernung der Hirnhäute fort, bis das Kleinhirn ein mattweißes Aussehen annimmt. Trennen Sie anschließend das Kleinhirn vom restlichen Mittelhirn ab.

Drehen Sie es auf die ventrale Seite und entfernen Sie das Plexus choroideus, das wie ein rötlicher Streifen zwischen dem ventralen Kleinhirn und dem angrenzenden Mittelhirn aussieht. Sobald das Kleinhirn präpariert ist, legen Sie es in kalte HBSS-Glukose in den 15-Milliliter-Konustube auf Eis. Nach der Präparation von drei Gehirnen ersetzen Sie die Präparationslösung durch frische HBSS-Glukose.

Wenn Sie mit der Kleinhirndissektion vertrauter werden, versuchen Sie, die Dauer der Dissektion auf nicht mehr als sechs Minuten pro Wurf begrenzen. Sobald die Dissektionen abgeschlossen sind, fahren Sie mit der Zellsuspension fort. Schritt: Erzeugen einer Zellsuspension aus den Kleinhirndissektionen.

Entfernen Sie zunächst das HBSS-Glukose aus dem Röhrchen und ersetzen Sie es durch Papain-Lösung. Obwohl das Kit empfiehlt, das Gewebe in kleine Stücke zu schneiden, stellen wir fest, dass dies in diesem Alter nicht notwendig ist. Geben Sie das Gewebe zusammen mit der Papain-Lösung für 15 bis 20 Minuten in einen Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C.

Für vier bis acht Cerebella 15 Minuten inkubieren. Bei einer größeren Anzahl bis zu einer halben Stunde inkubieren. Das Gefäß alle drei bis vier Minuten vorsichtig schütteln.

Nach Beendigung der Inkubation beginnen Sie den Schritt der Beschichtung: Beschichten Sie eine sterile P-1000-Aerosol-Pipettenspitze mit FBS, indem Sie zweimal auf- und abpipettieren. Triggern Sie nun die Mischung. Achten Sie darauf, vorsichtig zu pipettieren, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.

Ungefähr 10 Auf- und Ab-Bewegungen mit der Pipette sind ausreichend, um das Gewebe zu dissoziieren. Die Lösung sollte trüb werden. Lassen Sie die Suspension 30 bis 60 Sekunden stehen, damit sich eventuelle größere Stücke nicht dissoziierten Gewebes am Boden des Gefäßes absetzen können.

Obwohl feuerpolierte Glaspipetten für die Pipettierung verwendet werden können, stellen wir fest, dass sterilen, serumbeschichteten P-1000-Pipettenspitzen genauso gut geeignet sind. Danach überführen Sie die suspendierten Zellen mit einer serumbeschichteten Pipettenspitze in ein frisches 15-ml-Konischgefäß und achten Sie darauf, die nicht assoziierten Gewebestücke am Boden nicht mitzunehmen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension etwa fünf Minuten bei 200 ×g.

Bei Raumtemperatur während des Zentrifugierens das Re-Suspendierungsmedium vorbereiten. Dazu 2,7 Milliliter EBSS in ein steriles Gefäß geben. Anschließend 300 Mikroliter der rekonstituierten Albumin-OVO-MOID-Hemmlösung hinzufügen.

Schließlich 150 Mikroliter der DNA-Lösung hinzufügen. Nach Abschluss der Zentrifugation das Überstandsvolumen verwerfen und das Zellpellet sofort in der verdünnten DNA-Albumin-Inhibitorlösung resuspendieren. Verwenden Sie erneut eine mit Serum beschichtete Pipettenspitze, um das Pellet zu resuspendieren.

Bereiten Sie nun ein diskontinuierliches Dichtegradienten vor. Geben Sie hierzu fünf Milliliter der Albumin-Oval-MOID-Inhibitorlösung in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig entlang der Wand des Gefäßes auf die Lösung auf und zentrifugieren Sie anschließend etwa sechs Minuten bei 70 ×g.

Bei Raumtemperatur pelletieren die dissoziierten Zellen am Boden des Röhrchens, während die Membranfragmente an der Phasengrenze verbleiben. Wenn Sie Kulturen anreichern möchten, die angereichert an Granulazellen sind, ist keine weitere Reinigung erforderlich. Entsorgen Sie den SUP-Überstand und resuspendieren Sie das Pellet sofort in vier Millilitern 10 % FBS-Medium mit 50 Mikrolitern DNAs.

Filtrieren Sie diese Suspension durch ein Nylongewebe mit einer Porengröße von 70 Mikrometern unter Schwerkraft. Dieser Schritt entfernt große nicht-neuronale Zellen und sorgt für eine bessere Einzelzell-Suspension. Danach überspringen Sie den folgenden Schritt der Dichtegradiententrennung und fahren Sie mit dem Zellplattierungsschritt fort.

Oder wenn Sie die Granulazellen weiter von Gliazellen und großen Interneuronen reinigen möchten, fahren Sie mit dem Percoll-Gradienten fort. Schritt: Verwerfen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet unverzüglich in zwei Milliliter HBSS mit Glukose und 50 Mikrolitern DNase.

Nochmals die Suspension durch ein Nylon-Netz filtern. Vor Beginn der Percoll-Gradiententrennung zwei flammenglasierte Pasteur-Pipetten herstellen. Die Spitze einer Pipette vorsichtig mit der Flamme glühen, bis die Kante glatt ist und die Öffnung der Pipette etwa die Hälfte der ursprünglichen Größe beträgt. Dabei darauf achten, die Öffnung nicht zu klein zu machen.

Stellen Sie nun den Percoll-Gradienten her. Geben Sie 10 ml einer 35 %igen Percoll-Lösung in ein steriles 50-ml-Konischgefäß. Danach füllen Sie 10 ml einer 60 %igen Percoll-Lösung in eine sterile 10-ml-Spritze, die mit einer sterilen Spinalnadel verbunden ist.

Schichten Sie die 60 %ige Lösung vorsichtig unter die 35 %ige Lösung, indem Sie die Spritze so auf den Boden des Röhrchens aufsetzen. Achten Sie darauf, eine scharfe Grenzfläche zwischen den beiden Schichten zu erhalten. Geben Sie anschließend die Zellen auf die Oberseite des Gradienten.

Unter Verwendung einer feuerpolierten Pipette die Zellen vorsichtig entlang der Röhrenwand hinzufügen, ohne die Grenzfläche zu stören. Nach dem sorgfältigen Schichten der Zellen die Röhre vorsichtig in die Zentrifuge stellen. Die Zentrifugation bei etwa 18 G beginnen. Die Geschwindigkeit in Ein-Minuten-Schritten alle 20 Sekunden erhöhen, sodass etwa zwei Minuten benötigt werden, um 1800 G zu erreichen. Nach 10 Minuten bei 1800 G die Geschwindigkeit schrittweise alle 20 Sekunden langsam verringern.

Wenn der Lauf beendet ist, entfernen und verwerfen Sie die obere Grenzfläche des Gradienten. Diese Grenzfläche enthält große ggl Bikini-Zellen und Interneurone. Verwenden Sie anschließend eine feuerpolierte Pipette, um die Zellen an der Grenzfläche vorsichtig zu entfernen.

Überführen Sie die Zellen in ein 50-mL-Gefäß. Falls das Volumen größer als 15 mL ist, verteilen Sie sie auf zwei 50-mL-Gefäße und resuspendieren Sie sie in dreifachem Volumen HB S'S Glukose durch mehrmaliges Vorsichtig Umstülpen mischen. Zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten bei 1100 ×g. Entfernen Sie nun den Überstand und geben Sie vier mL Medium mit 10 % FBS sowie 50 Mikroliter D ns reus hinzu.

Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer feuerpolierten Pipette, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen. Sobald die Zellen resuspendiert sind, fahren Sie mit der Präpl-Phase fort. Die Zellen präplatieren die gesammelten Zellen 20 Minuten lang auf einer mit Poly-Lysin beschichteten Schale.

In einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Während der Inkubation setzen sich die Astroglia und schwereren Zellen ab und haften an den Schalen, während die kleinen Granulaneurone und neuronalen Vorläuferzellen im Schwarm verbleiben oder locker angeheftet sind. Nach 20 Minuten vorsichtig auf die Schale klopfen, um locker angeheftete Granulazellen zu lösen.

Überführen Sie dann die Zellsuspension in eine frische, mit Poly-D-Lysin beschichtete Platte und wiederholen Sie die Inkubation. Sammeln Sie anschließend die Granulaneurone und neuronalen Vorläuferzellen in einem 15-ml-Konischgefäß und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 200 × g. Resuspendieren Sie dann das Pellet in einem ml C-freiem Medium und zählen Sie mithilfe eines Hämozytometers.

Schließlich fügen Sie serumfreies Medium hinzu, um die gewünschte Zelldichte für die Aussaat mit mittlerer Dichte zu erreichen. Für sechswellige Platten. Verwenden Sie etwa 3,5 bis 4 Millionen Zellen für vierschälige Platten.

Verwenden Sie 650.000 Zellen. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37-Grad-Inkubator mit 5 % CO2. Ersetzen Sie das Medium vollständig 24 Stunden nach der initialen Aussaat und danach alle zwei bis drei Tage.

Hier sind einige Bilder gesunder Granulaneuronen- und Vorläuferzellkulturen. 24 Stunden nach der Aussaat und sechs Tage nach der Aussaat. Diese Zellen können bis zu zwei Wochen lang in Kultur gehalten werden.

Beachten Sie, dass gesunde Zellen innerhalb von 24 Stunden nach der Aussaat gleichmäßig auf den Deckgläsern oder dem Kunststoff-Well verteilt sind und Fortsätze ausbilden. Zellklumpen und das Vorhandensein von Varikositäten an den Zellfortsätzen weisen darauf hin, dass die Zellen geschädigt sind oder dass das Poly-Lysin-Substrat toxisch wirkt. Wie in der Abbildung zu sehen, beginnen Granulatneuronen-Progenitoren unmittelbar nach der Aussaat zu differenzieren und exprimieren spezifische Marker.

Vertreter ihrer Differenzierung. Die Proliferation von Granulaneuronen-Progenitoren kann durch Zugabe von Sonic Hedgehog zum Medium erheblich verlängert werden. Laminin kann zusätzlich zu Polylysin als Substrat hinzugefügt werden, um das Neuritenwachstum zu fördern.

Diese Eigenschaften der Granulazellkultur bieten ein System zur Untersuchung entweder der Biologie von Granulaneuronen oder der Regulation der Differenzierung von Vorläuferzellen in Neuronen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man MAO-Cerebellum-Granulazell-Vorläuferzellen und -Neuronen isoliert und kultiviert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die ungefähre Ausbeute 4 bis 5 × 10⁶ beträgt.

Pro Mauswelpen sind sechs Zellen pro Welpen anzusetzen, und die Ansiededichten können zwischen dem Fünffachen der Zellen pro Quadratzentimeter liegen. Wenn daher der Percoll-Gradientenschritt übersprungen wird, können acht Mauswelpen am fünften postnatalen Tag in meiner Hand genügend Zellen für sechs Vier-Well-Kulturplatten liefern. Die Anwendung des Percoll-Gradientenschritts verringert die Zellausbeute jedoch um etwa 25 %. Der Anteil der Granulaneurone in den Kulturen steigt jedoch von 90–95 % auf 99 % an. Angereicherte Granulazellen, die ohne die Percoll-Gradiententrennung gewonnen wurden, wurden verwendet, um die Regulation der Proliferation und Differenzierung von Granulaneuron-Vorläuferzellen zu untersuchen. Wenn die Kulturen jedoch über mehrere Tage *in vitro* verwendet werden sollen, wird die Einbeziehung des Percoll-Gradientenschritts empfohlen, um die Kontamination der Granulaneurone durch proliferierende nicht-neuronale Zellen zu verringern.

Stellen Sie außerdem sicher, dass die Lösungen, die zur Herstellung des Per-Cot-Gradienten verwendet werden, frisch sind, da eine unzureichende Pufferung zu stärkerem Zelltod führt. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.