Name: Retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Descubre Magnify, una técnica de microscopía de expansión que amplía muestras hasta 11 veces preservando biomoléculas. Permite imagen nanométrica de alta resolución sin equipos especializados en diversos tejidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por la Universidad Carnegie Mellon y la Fundación Benéfica D.S.F. (Y.Z. y X.R.), los Institutos Nacionales de Salud (N.I.H.) Premio al Nuevo Innovador del Director DP2 OD025926-01, y la Fundación Kauffman.

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Carnegie Mellon. Se obtuvieron muestras de tejido humano de forma comercial.
1. Preparación de los reactivos y soluciones madre
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los reactivos utilizados.
<ol><li>Prepare las soluciones madre gelificantes. Estos se combinarán inmediatamente antes del paso de gelificación.<ol><li>Preparar la solución madre monómera (4 g/100 mL DE ÁCIDO N,N-dimetilacrilamida [DMAA], 50 g/100 ml de acrilato de sodio [SA], 66,7 g/100 ml de acrilamida [AA], 0,10 g/100 ml de N,N′-metilenebisacrilamida [Bis], 33 g/100 ml de cloruro de sodio [NaCl], 1x solución salina tamponada con fosfato; PBS) utilizando los componentes enumerados en la Tabla 1. Disolver o diluir todas las soluciones madre en agua. La solución madre de monómero puede almacenarse a 4 °C durante al menos 3 meses.</li>
		<li>Envasar las siguientes soluciones madre por separado en agua: 4-Hidroxi-TEMPO (4HT) al 0,5% (p/p), que inhibe la gelificación durante la difusión del monómero en los tejidos, y tetrametilenilendiamina (TEMED) al 10% (p/p), que acelera la generación de radicales iniciada por el persulfato de amonio (APS) y se prepara al 10% (p/p). NOTA: Las soluciones madre pueden distribuirse en alícuotas de 1-2 ml y almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses; sin embargo, el APS se realiza inmediatamente antes de preparar la solución gelificante.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare el tampón de homogeneización (1% p/v de S.D.S., 8 M de urea, 25 mM de EDTA, 2x PBS, pH 8, a temperatura ambiente [R.T.]) combinando 1 g de SDS, 48,048 g de urea, 5 mL de EDTA (0,5M, pH 8), 20 mL de 10x PBS, 25 mL de Tris (2 M) y 0,75 g de glicina. Agregue agua hasta obtener un volumen total de 100 ml. La solución se puede ampliar o reducir según sea necesario y se puede almacenar en R.T.</li>
</ol>2. Preparación de tejidos para portaobjetos de tejidos clínicos archivados y recién preparados
NOTA: Los pasos de preprocesamiento de tejidos difieren según la forma en que se preparen las muestras.
<ol><li>En el caso de las muestras clínicas incluidas en parafina fijadas en formaldehído (FFPE), siga los pasos que se indican a continuación.<ol><li>Coloque las muestras en una serie secuencial de soluciones (se puede usar un frasco de tinción de vidrio o un tubo cónico de 50 ml): xileno, etanol al 95%, etanol al 70% y etanol al 50%, seguido de agua doblemente desionizada. Use cada solución dos veces durante al menos 3 minutos cada vez. Use fórceps para colocar el portaobjetos en el recipiente y agregue 15 ml de la solución respectiva (suficiente para cubrir la muestra). Coloque el tubo cónico tapado horizontalmente en un agitador a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Para muestras teñidas y montadas en portaobjetos permanentes, siga los pasos a continuación.<ol><li>Coloque el portaobjetos brevemente en xileno y retire con cuidado los cubreobjetos con una herramienta adecuada, como una cuchilla de afeitar. Si el cubreobjetos permanece atascado, vuelva a colocar los portaobjetos en xileno a temperatura ambiente hasta que se afloje.</li>
		<li>A continuación, procese las muestras como muestras FFPE (paso 2.1.1). NOTA: En el caso de los portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina (H&E), la tinción de hematoxilina y eosina se pierde durante el proceso de expansión.</li>
	</ol></li>
	<li>Para portaobjetos de tejido congelado no fijados en solución de temperatura óptima de corte (OCT), fije los tejidos en acetona a -20 °C durante 10 min antes de lavar las muestras con 1x solución de PBS tres veces durante 10 min cada vez a temperatura ambiente.</li>
	<li>En el caso de los portaobjetos de tejido clínico congelados previamente fijados, derrita la OCT incubando los portaobjetos durante 2 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, lávelos con 1 solución de PBS tres veces durante 5 minutos cada vez a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. Preparación de tejidos para cerebro de ratón fijado en paraformaldehído
<ol><li>Siga este protocolo para secciones de cerebro de ratón de 30-50 μm de grosor. NOTA: Se puede tener éxito con secciones más grandes, pero es posible que se requieran tiempos más largos para la difusión y homogeneización de la solución de monómero.</li>
	<li>Si las secciones no están almacenadas actualmente en una solución de 1x PBS (por ejemplo, en una solución de glicerol al 30% [v/v] y etilenglicol al 30% [v/v] en 1x PBS), lávese tres veces durante al menos 10 minutos cada vez a temperatura ambiente en 1x PBS en una placa de 6 a 24 pocillos.</li>
	<li>Obtenga un portaobjetos de microscopía de vidrio sin recubrimiento. Si un lado del portaobjetos de vidrio está recubierto, use un pincel húmedo para verificar el lado no recubierto (a menudo, la etiqueta del lado recubierto estará hecha de vidrio esmerilado y se volverá menos opaca cuando esté mojada).</li>
	<li>Usa un pincel para humedecer el portaobjetos sin recubrimiento. Retire el tejido cerebral del ratón de la placa de pocillos con el pincel y colóquelo con cuidado en el portaobjetos, con un movimiento giratorio para asegurarse de que el tejido esté plano. Deje que el exceso de PBS permanezca en el tejido hasta que todas las secciones estén montadas. NOTA: Si bien se puede usar un solo portaobjetos de vidrio para múltiples secciones de tejido, cuando se gelifican más secciones de tejido a la vez (incluso en portaobjetos separados), se debe tener más cuidado para asegurarse de que no se sequen por completo.</li>
	<li>Con un paño de papel de laboratorio, retire la mayor parte del exceso de PBS del portaobjetos. Deja un pequeño anillo líquido alrededor de cada sección de tejido, pero deja el resto del portaobjetos casi seco. Este líquido restante cubrirá el tejido mientras se prepara la solución de monómero en gel.</li>
</ol>4. Gelificación
NOTA: Este protocolo es adecuado para todos los tipos de tejidos preparados para su uso con esta técnica.
<ol><li>Aplique espaciadores a ambos lados de la sección de tejido (Figura 2A) para evitar la compresión del tejido. Para hacerlo, haga los espaciadores cortando finamente trozos de cubreobjetos con un bolígrafo con punta de diamante, y luego asegúrelos al portaobjetos con pequeñas cantidades de agua o 1x PBS, o fíjelos con una pequeña cantidad de superpegamento. A continuación, coloque suavemente los espaciadores a ambos lados del pañuelo.</li>
	<li>Preparar la solución gelificante final. Generalmente, ~200 μL es suficiente por sección de tejido, pero el volumen no debe exceder los 800 μL por portaobjetos. Cualquier solución gelificante adicional provocará derrames. NOTA: La metacroleína se utiliza para anclar biomoléculas en el gel. Sin embargo, no se requiere ningún paso de anclaje por separado, y la metacroleína se puede agregar directamente a la solución gelificante final.<ol><li>Por sección, combine lo siguiente en orden: 200 μL de solución de monómero, 0,5 μL de solución madre 4HT al 0,5% (dilución 1:400), 0,2-0,5 μL de metacroleína (dilución 1:400-1:1.000 dependiendo del tipo de tejido; generalmente, utilice una dilución 1:1.000 para muestras fijadas con paraformaldehído [PFA] y 1:400 para muestras clínicas FFPE), 2 μL de solución madre TEMED al 10% (dilución 1:100), y 5 μL de solución madre de A.P.S. al 10% (dilución 1:40). NOTA: Prepare la solución gelificante final inmediatamente antes de usarla. Para evitar la gelificación prematura, agregue la solución APS al final.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire el exceso de solución de la sección de tejido y coloque el portaobjetos en una placa de Petri. Añadir a la muestra toda la solución gelificante fría recién preparada e incubar la mezcla en el tejido durante 30 min a 4 °C para permitir su difusión en el tejido.</li>
	<li>Coloque un segundo portaobjetos de vidrio sin recubrimiento con cuidado sobre el pañuelo y la solución de gel. Deben evitarse las burbujas de aire (Figura 2B). NOTA: Si las burbujas de aire quedan atrapadas sobre el pañuelo, la tapa de vidrio puede levantarse con cuidado y volver a colocarse. Además, cualquier solución de monómero que se derrame puede recortarse después de la polimerización y no causará ningún problema para el tejido.</li>
	<li>Asegúrese de que se complete la polimerización. Esta polimerización se puede realizar de dos maneras, cada una de las cuales produce resultados similares. En primer lugar, incubar las muestras a 37 °C en un ambiente humidificado (como una placa de Petri cerrada con una toalla de papel húmeda) durante la noche. Alternativamente, para una polimerización más rápida, incubar las muestras en la atmósfera humidificada durante 2 h a 37 °C seguido de 1 h a 60 °C.</li>
</ol>5. Digestión de la muestra y expansión del tejido
NOTA: Este protocolo es adecuado para todo tipo de tejidos.
<ol><li>Con protección para los ojos, deslice una hoja de afeitar entre los dos portaobjetos de vidrio de la cámara de gelificación para separarlos. NOTA: Los portaobjetos de vidrio deben separarse muy fácilmente. Si diferentes partes del gel están pegadas a ambos portaobjetos, se puede usar un pincel para guiar el gel hacia uno u otro. Si el gel se ha vuelto particularmente seco durante la polimerización, se puede aplicar 1x PBS en el exterior de la cámara de gel, pero no sumerja el gel por completo, ya que esto hará que se expanda antes de que el tejido se homogeneice, lo que provocará grietas.</li>
	<li>Recorta el gel en blanco alrededor del pañuelo para minimizar el volumen. Cortar el gel de forma asimétrica permite el seguimiento de la orientación del gel después de la homogeneización, ya que la muestra será completamente transparente.</li>
	<li>Levante suavemente el gel que contiene pañuelos del portaobjetos con una cuchilla de afeitar y transfiéralo suavemente a un tubo de centrífuga de 2 ml con una brocha.</li>
	<li>Llene el tubo hasta la parte superior con tampón de homogeneización (Tabla 2) precalentado a 80 °C.</li>
	<li>Incubar la muestra agitándola a 80 °C durante 8 h (para el cerebro de ratón fijado con PFA) o 60 h (la mayoría de las muestras clínicas FFPE; ver Tabla 3). NOTA: El tiempo de homogeneización depende del tipo de tejido y del método de fijación. Muchas de estas condiciones ya han sido validadas, pero para otras, la optimización puede ser necesaria.</li>
	<li>Vierta el contenido del tubo de centrífuga en un solo pocillo de una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos.</li>
	<li>Retire el tampón de desnaturalización con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Para eliminar completamente la FDS restante del hidrogel, lavar la muestra en una solución de tensioactivo no iónico al 1% (C12E 10) de la siguiente manera: al menos tres veces durante10 minutos cada vez a temperatura ambiente; durante 60 min a 60 °C; y luego otros tres lavados durante 10 minutos cada vez a temperatura ambiente.</li>
	<li>Almacene la muestra en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C hasta que sea necesario realizar la tinción posterior a la expansión y la obtención de imágenes. NOTA: En este punto, la muestra debe ser ~3-4.5 veces más grande en cada dimensión, dependiendo del tipo de tejido.</li>
</ol>6. Perfil de biomoléculas post-expansión
<ol><li>Tinción de anticuerpos NOTA: Esto sigue un protocolo típico de tinción de inmunofluorescencia (FI)/inmunohistoquímica (IHC). Las cantidades de anticuerpos primarios y secundarios utilizados dependen de las concentraciones sugeridas por el fabricante o de la optimización para el experimento específico. Los búferes individuales pueden ser sustituidos a discreción del usuario.<ol><li>Con la muestra en un solo pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos, lavar las muestras expandidas tres veces durante 10 minutos cada vez en 1x PBS en R.T., transfiriendo el líquido con una pipeta.</li>
		<li>Realice un paso de bloqueo opcional (por ejemplo, 3 % de albúmina sérica bovina/0,1 % de Triton-X100 en 1x PBS) durante al menos 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Incubar con los anticuerpos primarios en tampón de tinción (por ejemplo, Triton-X100 al 0,1 % 1x PBS o 9 veces PBS/TritonX al 1 %/10 mg/L de heparina) durante la noche a 37 °C. Dependiendo del tamaño de la muestra, 0,5-2 ml deberían cubrir adecuadamente el gel.</li>
		<li>Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar en los anticuerpos secundarios correspondientes durante 3 h a 37 °C en el tampón de tinción de elección.</li>
		<li>Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción de panproteína de éster NHS<ol><li>Con la muestra en una placa de 6 pocillos, vierta 1-2 ml de polietilenglicol (PEG 200) sobre la muestra (lo suficiente para cubrirla por completo). NOTA: El tejido debe encogerse y volver a su tamaño original antes de la expansión (o cerca de él).</li>
		<li>Manchar con éster NHS conjugado con fluoróforos diluido a 13,3-80 μg/ml durante 3 h a R.T. en 1-2 ml de tampón de tinción (por ejemplo, 1x PBS, 2x S.S.C. o 100 mM de solución de bicarbonato de sodio).</li>
		<li>Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción lipídica NOTA: La tinción lipídica posterior a la expansión no es eficaz en muestras clínicas FFPE, ya que los lípidos se pierden durante el proceso de fijación.<ol><li>Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aplicar un colorante lipofílico convencional (DiO, DiI o DiD) diluido 200 veces en 2 ml de TritonX-100/1x PBS al 0,1% durante 72-96 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar al menos tres veces con 1x PBS</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridación fluorescente in situ (FISH)<ol><li>Colocar las muestras de gel homogeneizadas en un tampón de hibridación precalentado a 60 °C durante 30 min.</li>
		<li>Prepare el tampón de hibridación para FISH: Combine 2x S.S.C. (300 mM de NaCl, 30 mM de citrato de sodio, pH 7,0), 10% (v/v) de sulfato de dextrano, 20% (v/v) de carbonato de etileno y 0,1% (v/v) de Tween20.</li>
		<li>Incubar las muestras de gel con un tampón de hibridación que contenga 10 pM (por oligo) de sondas FISH contra el gen diana (al menos 20 sondas por 10 kb) a 45 °C durante la noche.</li>
		<li>Lavar con tampón de lavado estricto (2x S.S.C. y 0,1% Tween20) dos veces durante 15 min cada vez a 45 °C.</li>
		<li>Lavar con tampón de lavado estricto otras dos veces durante 10 minutos cada vez a 37 °C.</li>
		<li>Finalmente, lavar con 1x PBS al menos tres veces durante 10 minutos cada vez a temperatura ambiente.</li>
		<li>Las muestras están listas para la obtención de imágenes o el almacenamiento en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Expansión tisular completa e imágenes de fluorescencia NOTA: El factor de expansión que se puede obtener con Magnify varía según el tipo de tejido y el método de expansión (se puede encontrar un resumen completo en la Tabla 3). Sin embargo, como estimación general, una muestra de Magnify se expandirá de 3 a 4,5 veces en 1x PBS, de 5 a 7 veces en PBS diluido a 1:50 en ddH 2O y de 8 a 11 veces en ddH2O. El factor de expansión óptimo para la obtención de imágenes depende de las necesidades de cada experimento. El factor de expansión es altamente ajustable, de modo que una sola muestra puede expandirse y reducirse muchas veces para obtener imágenes a varias escalas.<ol><li>Mueva las muestras expandidas 4 veces en PBS a una placa de imágenes de 6 pocillos con fondo de vidrio con un pincel. Mueva cualquier muestra expandida cortándola en trozos más pequeños o colocándola suavemente en una placa grande de imágenes con fondo de vidrio con un trozo delgado de plástico flexible.</li>
		<li>Realice imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio convencional de campo amplio, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección. Eliminar el exceso de líquido alrededor del gel con un paño de papel de laboratorio puede impedir el movimiento del gel durante la toma de imágenes. Los geles también se pueden inmovilizar aplicando poli-L-lisina al 0,1% a la superficie del vidrio antes de la obtención de imágenes. NOTA: La aplicación de poli-L-lisina hará que el gel quede completamente inmóvil al contacto. Por esta razón, se debe tener cuidado de que el gel se aplique al vidrio sin doblarse ni estirarse. Además, no se debe permitir que el gel se seque completamente en el vidrio recubierto de poli-L-lisina, ya que esto podría dificultar la extracción, y el gel no debe encogerse en PBS mientras aún está unido al vidrio con poli-L-lisina, ya que esto podría causar daños en el gel o en los tejidos.</li>
		<li>Después de la obtención de imágenes, reduzca las muestras en 1x PBS con al menos tres lavados durante 10 minutos cada vez, ya que no se recomienda almacenar las muestras a largo plazo en ddH2O debido a la degradación de la señal de fluorescencia. En particular, las muestras completamente expandidas teñidas con colorantes lipofílicos deben tomarse imágenes lo más cerca posible del momento de la expansión para evitar la disociación del colorante en agua.</li>
		<li>Almacenar las muestras en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

Microscopía de expansión para una expansión robusta de 11 veces

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+A+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+R.N.A.+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+R.N.A.+detection+approach+with+super-resolution+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), 165(2016).</li>
<li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+R.N.A.s+with+MERFISH+and+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4847(2018).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-ExM+enables+expansion+microscopy+for+all+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules.</a> Nature Methods. 18, 107-113 (2021).</li>
<li>White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Lipid expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).</li>
<li>Chang, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-preserving+magnified+analysis+of+proteome+%28eMAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP).</a> Science Advances. 7 (46), (2021).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. , (2023).</li>
<li>Gao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+stimulated+emission+depletion+microscopy+%28ExSTED%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED).</a> ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).</li>
<li>Zwettler, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+resolution+imaging+by+post-labeling+expansion+single-molecule+localization+microscopy+%28Ex-SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM).</a> Nature Communications. 11, 3388(2020).</li>
</ol>

Los autores declaran los siguientes intereses financieros contrapuestos: Y.Z., A.K., Z.C. y B.R.G. inventaron varias invenciones relacionadas con Magnify y ExM.

Aquí, presentamos el protocolo Magnify 17, una variante ExM que puede retener múltiples biomoléculas con un solo anclaje químico y expandir muestras clínicas FFPE desafiantes hasta11 veces con desnaturalización por calor. Los cambios clave en este protocolo que lo distinguen de otros protocolos ExM incluyen el uso de un gel reformulado que permanece mecánicamente robusto incluso cuando está completamente expandido, así como el uso de metacroleína como anclaje de la biomolécula. Los pasos más críti...

Los sistemas biológicos exhiben heterogeneidad estructural, desde las extremidades y los órganos hasta los niveles de proteínas a nanoescala. Por lo tanto, una comprensión completa del funcionamiento de estos sistemas requiere un examen visual a través de estas escalas de tamaño. Sin embargo, el límite de difracción de la luz causa desafíos en la visualización de estructuras más pequeñas que ~200-300 nm en un microscopio de fluorescencia convencional. Además, los métodos ópticos de superresolución 1,2,3, como el agotamiento de la emisión estimulada (STED), la microscopía de localización fotoactivada (PALM), la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de iluminación estructurada (SIM), aunque potentes, presentan sus propios desafíos, ya que requieren hardware y reactivos costosos y, a menudo, tienen tiempos de adquisición lentos y una capacidad deficiente para obtener imágenes de grandes volúmenes en 3D.
La microscopía de expansión4 (ExM) proporciona un medio alternativo para eludir el límite de difracción de la luz mediante el anclaje covalente de biomoléculas en un gel polimérico hinchable en agua y separarlas físicamente, lo que las hace resolubles en microscopios ópticos convencionales. Desde la publicación original de ExM hace menos de una década, se han desarrollado multitud de variantes del protocolo ExM, y estos protocolos permiten la incorporación directa de las proteínas 5,6,7, ARN 8,9,10 o lípidos11,12,13 en la red de gel alterando el anclaje químico o expandiendo aún más la muestra (mejorando así la resolución efectiva), ya sea en un solo paso14 o en múltiples pasos iterativos15,16. Hasta hace poco, ningún protocolo ExM podía retener estas tres clases de biomoléculas con un solo anclaje químico disponible comercialmente, al tiempo que proporcionaba un gel mecánicamente resistente que podía expandirse ~ 10 veces en una sola ronda de expansión.
Aquí, presentamos Magnify17, una adición reciente al arsenal de ExM que utiliza metacroleína como ancla de biomolécula. La metacroleína forma enlaces covalentes con el tejido como el del paraformaldehído, lo que garantiza que se puedan retener múltiples clases de biomoléculas dentro de la red de gel sin necesidad de varios agentes de anclaje específicos o personalizados. Además, esta técnica puede expandir un amplio espectro de tejidos hasta 11 veces, incluidas muestras notoriamente desafiantes, como las muestras clínicas fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE). Los métodos anteriores para expandir muestras mecánicamente rígidas requerían una digestión dura de las proteasas, lo que hacía imposible el marcaje de anticuerpos de las proteínas de interés después de que la muestra se había expandido. Por el contrario, esta técnica logra la expansión de muestras clínicas FFPE utilizando una solución desnaturalizante en caliente, preservando así los epítopos de proteínas enteras dentro del gel, que pueden ser dirigidos para la obtención de imágenes posteriores a la expansión (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>4-hidroxi-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Inhibidor</td></tr><tr><td>de 176141 Placa de fondo de vidrio de 6 pocillos (cubreobjetos #1.5)</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td>Gel Componente de monómero</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Iniciador</td></tr><tr><td>DAPI (1 mg/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Decaetilenglicol mono dodecil éter (C12E10)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9769</td><td>Surfactante no iónico</td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante Nº 88 CM</td><td>General Tools</td><td>31116</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td></td><td></td>111000200</tr><tr><td>Etilendiaminotetraacético ácido (EDTA) 0,5 M</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td>Componente tampón de homogeneización</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td>Componente tampón de homogeneización</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Metacroleína</td><td>Sigma Aldrich 133035</td><td></td><td>Agente de anclaje</td></tr><tr><td>Micro cubierta Vidrio #1 (24x60mm)</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>Micro cubierta Vidrio #1.5 (24x60mm)</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;- Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Accelerator</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metilenebisacecrilamida (Bis)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7279</td><td>Componente de monómero de gel</td></tr><tr><td>N,N-dimetilacrilamida (DMAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>274135</td><td>Gel Componente del monómero</td></tr><tr><td>Nunclon 4 pocillos x 5 mL Plato de cultivo celular MultiDish</td><td>Thermo Fisher</td><td>167063</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Plato de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 15mL&nbsp; Thermo Fisher cónico</td><td></td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 50mL&nbsp; Cónico</td><td>Thermo Fisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincel Medidor</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>pH Solución</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>salina tamponada de fosfato (PBS), 10x Solución</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol&nbsp; 200</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3015</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K ( Grado de biología molecular)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Fischer Scientifc</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>Safelock Tubos de microcentrífuga 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3457</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Safelock 2,0 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3459</td><td></td></tr><tr><td>Acrilato de sodio (SA)</td><td>AK Scientific</td><td>R624</td><td>Gel Componente</td></tr> <tr>de monómero<td>Azida de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio tribásico dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Componente tampón de homogeneización</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Tampón de homogeneización Componente</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Tampón de homogeneización Componente</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces

Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy

Las imágenes a nanoescala de especímenes biológicos pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. En los últimos años, se ha demostrado que la microscopía de expansión (ExM) es una alternativa eficaz y de bajo coste a la microscopía óptica de superresolución. Sin embargo, se ha visto limitado por la necesidad de agentes de anclaje específicos y, a menudo, personalizados para retener diferentes clases de biomoléculas dentro del gel y por las dificultades para expandir los formatos de muestras clínicas estándar, como el tejido fijado en formol e incluido en parafina, especialmente si se desean factores de expansión más grandes o epítopos de proteínas preservados. Aquí, describimos Magnify, un nuevo método ExM para una expansión robusta de hasta 11 veces en una amplia gama de tipos de tejidos. Al utilizar metacroleína como anclaje químico entre el tejido y el gel, Magnify retiene múltiples biomoléculas, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, dentro del gel, lo que permite la obtención de imágenes a nanoescala de los tejidos en microscopios ópticos convencionales. Este protocolo describe las mejores prácticas para garantizar una expansión de tejido robusta y sin grietas, así como consejos para manipular y obtener imágenes de geles altamente expandidos.

Si el protocolo se ha completado con éxito (Figura 1), la muestra aparecerá clara y plana después de la desnaturalización por calor; Cualquier pliegue o arruga indica una homogeneización incompleta. Una muestra expandida con éxito será de 3 a 4,5 veces más grande que antes de la expansión en 1x PBS y de 8 a 11 veces más grande cuando esté completamente expandida en ddH2O. La Figura 3 muestra imágenes de ejemplo antes y después de la expansión de una m...

Aquí se presenta una nueva versión de microscopía de expansión (ExM), Magnify, que está modificada para una expansión de hasta 11 veces, conservando una amplia gama de clases de biomoléculas y es compatible con una amplia gama de tipos de tejidos. Permite la interrogación de la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios convencionales limitados por difracción.

Retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces

The nanoscale imaging of biological specimens can improve the understanding of disease pathogenesis. In recent years, expansion microscopy (ExM) has been ...

Estamos tratando de encontrar formas fáciles y de bajo costo para que los investigadores obtengan imágenes de sus especímenes biológicos con resoluciones por debajo del límite de difracción, particularmente en las áreas de neurociencia y patología clínica. Muchos desarrollos recientes de microscopía de expansión implican la modificación de la química del gel para expandir aún más las muestras, el cambio de la molécula de anclaje para visualizar diferentes objetivos y la utilización de la alteración del calentamiento para preservar los epítopos de las proteínas. Con la innovadora lupa, un método robusto de microscopía de expansión que permite obtener imágenes a nanoescala de diversas muestras biológicas o clínicas.Simplifica la microscopía de súper resolución al eliminar la necesidad de equipos especializados al tiempo que conserva las intrincadas características biológicas con una resolución de hasta 15 nanómetros, lo que aumenta la accesibilidad y la utilidad en los laboratorios de todo el mundo. Anteriormente, los usuarios tenían que experimentar con diferentes técnicas de microscopía de expansión, dependiendo del tejido y las biomoléculas que querían obtener imágenes. Magnify pe

universal-molecular-retention-with-11-fold-expansion-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Las imágenes a nanoescala de muestras de tejido clínico pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. La patología de expansión (ExPath) es una versión de la microscopía de expansión (ExM), modificada por compatibilidad con muestras de tejido sortea estándar, para explorar la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios limitados de difracción convencional.

Imágenes nanoscópicas de secciones de tejido humano a través de la expansión física e isotrópica

El método presentado permite visualizar proteínas celulares etiquetadas fluorescentemente con microscopía de expansión que conduce a una resolución de 70 nm en un microscopio convencional.

Imagen de las proteínas podocíticas nefrina, actina y podocina con microscopía de expansión

Se demuestra un protocolo de microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM). LR-ExM utiliza un novedoso conjunto de anclajes trifuncionales, que proporciona una mejor eficiencia de etiquetado en comparación con las microscopías de expansión introducidas anteriormente.

La microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM) permite obtener imágenes de superresolución y etiquetado de alta eficiencia

Aquí, se presenta un protocolo para la implementación de microscopía de expansión en embriones tempranos de Drosophila para lograr imágenes de superresolución utilizando un microscopio confocal convencional de barrido láser.

Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

Este estudio muestra un protocolo detallado para realizar microscopía de expansión de ultraestructura en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, el patógeno responsable de la enfermedad de Chagas. Incluimos la técnica optimizada para las proteínas del citoesqueleto y el marcaje panproteoma.

Microscopía de expansión ultraestructural en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi

Aquí, proponemos un protocolo simple que combina ingeniería de oligosacáridos metabólicos, química de clic y microscopía de expansión que permite la obtención de imágenes de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares con resolución mejorada utilizando equipos de microscopía de rutina.

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Aquí presentamos un protocolo detallado que combina métodos de criofijación y microscopía de expansión (Cryo-ExM), permitiendo imágenes de alta resolución con preservación estructural adaptada a diversas muestras biológicas. Las muestras biológicas se congelan, se incrustan en un polímero hinchable, se desnaturalizan, se expanden e se inmunomarcan, permitiendo obtener imágenes de superresolución con microscopios ópticos estándar.

Microscopía de expansión: Imagen fluorescente de alta resolución con microscopio convencional

En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Aquí nos demuestran los protocolos para la realización de una sola molécula de microscopía de fluorescencia en células vivas de las bacterias para permitir funcionales complejos moleculares para detectar, seguir y cuantificar.

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Este protocolo demuestra un sencillo de una sola molécula de la técnica de microscopía de fluorescencia para la visualización de la replicación del ADN por replisomes individuales en tiempo real.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

Descubre Magnify, una técnica de microscopía de expansión que amplía muestras hasta 11 veces preservando biomoléculas. Permite imagen nanométrica de alta resolución sin equipos especializados en diversos tejidos.

Retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces

Explorar más videos