Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

Búferes

Conceptos Preparación del instructor Protocolo del estudiante

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Los tampones son soluciones que trabajan para mantener un pH constante en un sistema, independientemente de la adición de ácidos o bases fuertes. En ausencia de tampones, la adición de un ácido fuerte o una base a una solución cambia significativamente el pH. Los amortiguadores son cruciales en la vida cotidiana. Por ejemplo, la sangre actúa como un amortiguador y es capaz de mantener un pH entre 7,35 y 7,45, ya que un pH superior a 7,8 o inferior a 6,8 puede causar la muerte.

Entonces, ¿cómo funciona un búfer? Un tampón es esencialmente un ácido o base débil y su base conjugada o ácido en equilibrio entre sí. Tomemos, por ejemplo, un tampón hecho de ácido acético y acetato de sodio. La solución tampón contiene un ácido débil y su sal conjugada, que se disocia para formar el acetato base conjugado. La solución es ácida porque el K_a del ácido acético es mayor que el K_b de la base conjugada.

Recordemos que la constante de disociación, K_a o K_b, define la fuerza del ácido o de la base, respectivamente, ya que es la constante de equilibrio para la disociación del compuesto en agua. La constante de disociación también se puede representar como pK_a, o el logaritmo negativo de K_a, donde cuanto menor es el pK_a, más fuerte es el ácido. Lo mismo ocurre con el pK_b, donde cuanto más pequeño es el pK_b, más fuerte es la base.

Volviendo al tampón de acetato, si añadimos una base fuerte, como el hidróxido de sodio, los iones hidróxido reaccionan con los iones hidronio presentes en la solución. Esto hace que más ácido acético reaccione con el agua para volver al equilibrio, formando así más iones de hidronio. Si añadimos un ácido fuerte, como el ácido clorhídrico, se forman más iones de hidronio en solución. Esos iones reaccionan con los iones de acetato para formar más ácido acético. En ambos casos, hay muy poco cambio en el pH de la solución.

Tenga en cuenta que cada tampón tiene un rango de pH específico en el que puede amortiguar una solución. Aquí mostramos una curva de valoración para nuestro tampón de ácido acético. Se resalta el rango de almacenamiento en búfer. Esta región está determinada por la ecuación de Henderson-Hasselbalch, que nos dice que el pH del tampón está determinado por el K_{a del} ácido débil y la relación entre la base conjugada y el ácido débil.

Lejos de este pH, el ácido débil o la base del tampón se agota y no puede amortiguar el pH. Por lo tanto, al seleccionar un tampón para su aplicación, elija uno cuyo pK_a esté cerca del pH deseado.

Finalmente, todos los tampones tienen un límite en su capacidad de tampón, es decir, la cantidad de ácido o una base que se puede agregar a la solución tampón antes de que el pH cambie significativamente. Por ejemplo, si añadimos demasiado ácido a nuestra solución tampón de ácido acético y acetato de sodio, protonaremos todos los iones de acetato y acumularemos una gran cantidad de iones hidronio, disminuyendo así el pH.

Del mismo modo, si añadimos demasiada base, desprotonaremos todo el ácido acético y acumularemos una gran cantidad de iones de hidróxido, aumentando así el pH. Por lo tanto, la capacidad amortiguadora está influenciada por la concentración del ácido débil y la sal conjugada. Por lo tanto, un tampón de acetato de 1 molar tiene una mayor capacidad de amortiguación que un tampón de acetato de 0,1 molar.

En este laboratorio, preparará y examinará tampones con una amplia variedad de rangos de pH. A continuación, utilizará sus tampones para determinar el pK_a de un indicador de pH, llamado rojo neutro, y explorará el cambio en el pK_a del rojo neutro cuando se introduce la proteína de unión a la riboflavina.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuente: Smaa Koraym de la Universidad Johns Hopkins, MD, EE.UU.

Preparando 50 mM NaH₂PO₄ Buffer, pH 7

En la primera parte de este experimento, preparará una solución de fosfato de sodio tamponada a pH 7.0. El fosfato monosódico es un ácido débil con la base conjugada, el fosfato disódico. Las soluciones de fosfato monosódico no ajustado suelen tener un pH de aproximadamente 4 a 6.

Los tampones son más efectivos cerca de su pKa, que es de 6,8 a 7,2 para el fosfato monosódico. Por lo tanto, utilizará NaOH para empujar el equilibrio hacia la base conjugada sin alterar la composición general del equilibrio del tampón.

Antes de comenzar el experimento, calcule la masa de fosfato monosódico que necesitará para hacer 200 mL de una solución de 50 mM.

Tabla 1: Preparación de 50 mM de tampón NaH₂PO₄, pH 7,0

Masa molar de NaH₂PO₄ = 119.98 g/mol
Volumen de la solución (mL)	200
Molaridad (mM)	50
Lunares de NaH₂PO₄ (mol)
Masa necesaria (mg)
Volumen inicial de 1 M de NaOH (mL)
Volumen final de 1 M de NaOH (mL)
Volumen de NaOH utilizado (mL)
Volumen de agua desionizada necesaria (mL)

Haga clic aquí para descargar la Tabla 1

Para empezar, ponte el equipo de protección personal necesario, incluyendo una bata de laboratorio, gafas de seguridad resistentes a salpicaduras y guantes. nota: Esta sección del laboratorio utiliza NaOH, que es corrosivo y tóxico. Tenga cuidado al verter y transportar NaOH.
Llena una botella de lavado de plástico de 250 ml con agua desionizada.
Etiquete dos vasos de precipitados de 100 ml, uno para residuos acuosos neutros y otro para residuos acuosos básicos.
Calibra tu medidor de pH utilizando los tampones proporcionados. Guarde la sonda en su solución de almacenamiento cuando haya terminado.
Tare papel de pesaje, y use una espátula limpia para medir la cantidad requerida de fosfato monosódico de acuerdo con sus cálculos. Registre la cantidad exacta de fosfato monosódico en su cuaderno de laboratorio. nota: El fosfato monosódico absorbe la humedad del aire, así que trabaje rápidamente para obtener una medición precisa y cierre bien el recipiente cuando haya terminado con él.
Coloque el fosfato monosódico en un vaso de precipitados de 400 ml y limpie la espátula con una toallita de laboratorio. Deseche el papel de pesaje y la toallita de laboratorio antes de volver a la campana extractora.
Utilice un cilindro graduado para medir 175 mL de agua desionizada. Vierta el agua en el vaso de precipitados de fosfato monosódico y agregue una barra magnética para agitar.
Remueve la solución hasta que la sal se haya disuelto completamente y la solución parezca homogénea. Esto suele tardar entre 2 y 3 minutos.
Mide 15 mL de agua desionizada y viértela en el vaso de precipitados. Continúe revolviendo la solución hasta que vuelva a parecer homogénea (aproximadamente 1 a 2 minutos). Apague el motor de agitación.
Enjuague la sonda de pH con agua desionizada y luego sujétela en la solución con el sensor por encima de la barra de agitación.
Lleve un cilindro graduado de 10 mL y un vidrio de reloj a la campana dispensadora y mida 10 mL de NaOH de 1 M. Anote el volumen exacto en el cilindro graduado.
Cubre tu NaOH con el cristal del reloj y llévalo con cuidado a tu campana extractora.
Reanuda agitando la solución de fosfato monosódico. Mientras controla la lectura del pH, use una pipeta desechable para agregar lentamente NaOH a la solución de agitación gota a gota. Una vez que el pH del tampón alcance 7,0, devuelva el NaOH que aún esté en la pipeta al cilindro graduado.
Calcula el volumen de NaOH que has añadido al buffer. Reste ese volumen de 10 mL para determinar cuánta agua desionizada debe agregar a su tampón para alcanzar un volumen total de solución de 200 mL.
Mide el agua desionizada con otro cilindro graduado de 10 mL y añádelo a la solución de agitación para terminar de hacer el tampón.
Enjuague el sensor de pH con agua desionizada, cúbralo con la tapa llena de solución de almacenamiento y desconecte o apague la sonda.
Etiquete una botella de polietileno de 250 mL como 'tampón de fosfato monosódico de 50 mM, pH 7.0'. Recupere la barra agitadora magnética de la solución.
Use un embudo para verter la solución tampón en la botella etiquetada y táplela herméticamente.

Espectroscopía de Absorción de Rojo Neutro Libre y Ligado
Los tampones se pueden utilizar para evaluar compuestos a valores de pH específicos. En esta sección, registrará el espectro de absorbancia del indicador rojo neutro en varios búferes. La forma protonada del rojo neutro es el rojo, y la forma desprotonada es el amarillo-naranja, lo que significa que absorben la luz verde y azul-violeta, respectivamente. Por lo tanto, las formas ácida y básica tienen distintas longitudes de onda de absorción. La unión a proteínas altera las propiedades del rojo neutro, cambiando tanto su absorbancia como su pKa.

Después de medir el espectro de absorbancia del rojo neutro libre a varios valores de pH, agregará la proteína de unión a riboflavina, o RP, a las soluciones y medirá las absorbancias nuevamente. La intensidad de la absorbancia está relacionada con la concentración, por lo que utilizará los espectros para determinar el pKa del rojo neutro libre y unido después del laboratorio.
- Dibuja la siguiente tabla en tu cuaderno de laboratorio. Numere las cubetas del 1 al 10 y haga una lista de los nueve valores de pH del tampón que utilizará. La 10ª cubeta será una mina de agua desionizada. nota: Sujete siempre las cubetas por los lados texturizados y limpie los lados transparentes justo antes de colocar la cubeta en el espectrofotómetro. Recuerde alinear los lados transparentes con el haz de luz del espectrofotómetro.
  Tabla 2: Absorción del rojo neutro libre y unido
  
  Cubeta # Tampón pH Abs. at λ_max(Libre NRH⁺) Abs. at λ_max (Bound NRH)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 en blanco
  Haga clic aquí para descargar la Tabla 2
- Obtenga diez cubetas y tapas de 1.5 mL y etiquete las tapas del 1 al 10 para que coincidan con la tabla en su cuaderno de laboratorio.
- Etiquete un vaso de precipitados de 25 ml como 'DIH2O' y llénelo con agua desionizada.
- Tira tus residuos acuosos neutros por el desagüe y vuelve a etiquetar el vaso de precipitados como 'residuos tampón acuosos'.
- Etiquete un vaso de precipitados de 400 ml para las puntas de micropipeta usadas.
- Conecte una punta a una micropipeta de 1 ml y utilícela para dispensar 1000 μL de agua desionizada en la cubeta 10. Este es su disolvente en blanco.
- Coloque 925 μL de su tampón de fosfato monosódico pH 7.0 en la cubeta 5.
- Lleva las cubetas vacías restantes a la tabla de búfer. Guiado por la tabla de su cuaderno de laboratorio, dispense 925 μl de cada tampón en la cubeta adecuada utilizando las micropipetas etiquetadas. Tenga cuidado de no utilizar la misma punta de pipeta para diferentes tampones.
- Una vez que hayas terminado, lleva los búferes de vuelta a tu banco de trabajo. Allí, coloque una micropipeta de 200 μL para dispensar 75 μL y coloque una punta en la micropipeta.
- Dispense 75 μL de rojo neutro en cada una de las nueve cubetas tampón. Invierta cada cubeta varias veces para mezclar bien las soluciones. nota: Sustituya la punta de la pipeta si entra en contacto con un tampón.
- Una vez que hayas mezclado el rojo neutro con cada búfer, toma una foto o escribe los colores de las soluciones.
- Enciende un espectrofotómetro de mano y deja que la fuente de luz se caliente. Una vez que esté listo, cree un nuevo experimento para medir la absorbancia frente a la longitud de onda para el rojo neutro libre.
- Inserte la cubeta de agua desionizada y adquiera un espectro del agua desionizada. Establézcalo como fondo solvente o en blanco.
- Luego, retire el blanco e inserte la cubeta de rojo neutro en el tampón de pH más bajo, que tendrá la concentración más alta de rojo neutro protonado.
- Adquiere un espectro, que debería mostrar un pico fuerte. Identifique la longitud de onda correspondiente al punto más alto de este pico, o el máximo. Registre esta longitud de onda en su cuaderno de laboratorio como lambda max para el rojo neutro libre protonado.
- Guarde los datos y retire la cubeta. Registre la absorbancia en su cuaderno, luego recoja los espectros de las cubetas 2 a 9 utilizando el mismo procedimiento.
- Registra la longitud de onda del punto isobástico en tu cuaderno de laboratorio. Ahí es donde todos los espectros se cruzan en una sola longitud de onda. Si un espectro no se cruza en ese punto, vacíe y limpie la cubeta, prepare una muestra nueva y vuelva a intentarlo.
- Una vez que termines de recolectar los espectros de las nueve cubetas, guarda y exporta los datos.
- Crea un nuevo experimento para medir la absorbancia frente a la longitud de onda para el rojo neutro ligado.
- Coloque una nueva punta en la micropipeta de 200 μL y añada 75 μL de solución de proteína de unión a riboflavina a cada cubeta, incluida la pieza en bruto. Expulse la punta, asegure las tapas de la cubeta e invierta la cubeta varias veces para mezclar las soluciones.
- Inserte la cubeta 10 en el espectrofotómetro y configúrela como disolvente en blanco.
- Adquiera un espectro de la muestra de pH más bajo e identifique la longitud de onda correspondiente al máximo del pico más intenso. Regístrelo en su cuaderno de laboratorio como lambda max de rojo neutro ligado a protonado.
- Adquiera espectros para las cubetas 2 - 9 de la misma manera que lo hizo para las muestras gratuitas de rojo neutro. Registre las intensidades en lambda max para el rojo neutro ligado a protones en su tabla, junto con la longitud de onda en el punto isosbónico.
- Cuando haya terminado, guarde sus datos, expórtelos para su posterior análisis y apague el espectrofotómetro.
- Guarde todo el equipo y deseche las puntas de pipeta usadas en un contenedor de residuos o en un cubo de basura aprobado.
- Vacíe las cubetas en el vaso de precipitados de residuos tampón acuoso y enjuague las cubetas en el vaso de precipitados con agua desionizada.
- Vacía el exceso de NaOH en la basura básica y enjuaga el cilindro graduado con agua.
- Tira los residuos acuosos básicos por el desagüe con abundante agua del grifo, junto con los demás residuos acuosos.
- Lave la cristalería, las tapas de las cubetas y la barra de agitación según los procedimientos estándar de su laboratorio. Limpie sus superficies de trabajo con una toalla de papel húmeda y deseche las toallas de papel y las toallitas de laboratorio usadas en la basura del laboratorio.
Resultadosexpandir
Ahora, analicemos nuestros datos de absorbancia para determinar los pKa del rojo neutro.

Tabla 3: Determinación de pKa's rojos neutros

NRH⁺ gratis Enlazado NRH⁺
λ_máx. (nm)
ΔA (nm)
Punto medio (nm)
pKa

Haga clic aquí para descargar la Tabla 3
- Trace ambos conjuntos de datos de intensidad con la intensidad de absorbancia en lambda max en el eje y y el pH en el eje x, con los puntos unidos por líneas suaves.
- Calcula la diferencia entre las intensidades de absorbancia inicial y final para cada serie de datos.
- Determine la absorbancia a medio camino entre las absorbancias inicial y final para cada serie, o los puntos medios de absorbancia.
- Encuentra dónde se encuentra el punto medio en cada línea e identifica el valor de pH en ese punto. Estos valores de pH son los pKa del rojo neutro libre y unido.
- Aquí, vemos un aumento en pKa de aproximadamente uno entre el rojo neutro libre y unido, lo que indica que el rojo neutro protonado unido es un ácido más débil que el rojo neutro protonado libre en un orden de magnitud.