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Fuente: Smaa Koraym de la Universidad Johns Hopkins, MD, EE.UU.
En la primera parte de este experimento, preparará una solución de fosfato de sodio tamponada a pH 7.0. El fosfato monosódico es un ácido débil con la base conjugada, el fosfato disódico. Las soluciones de fosfato monosódico no ajustado suelen tener un pH de aproximadamente 4 a 6.
Los tampones son más efectivos cerca de su pKa, que es de 6,8 a 7,2 para el fosfato monosódico. Por lo tanto, utilizará NaOH para empujar el equilibrio hacia la base conjugada sin alterar la composición general del equilibrio del tampón.
| Masa molar de NaH2PO4 = 119.98 g/mol | |
| Volumen de la solución (mL) | 200 |
| Molaridad (mM) | 50 |
| Lunares de NaH2PO4 (mol) | |
| Masa necesaria (mg) | |
| Volumen inicial de 1 M de NaOH (mL) | |
| Volumen final de 1 M de NaOH (mL) | |
| Volumen de NaOH utilizado (mL) | |
| Volumen de agua desionizada necesaria (mL) | |
Los tampones se pueden utilizar para evaluar compuestos a valores de pH específicos. En esta sección, registrará el espectro de absorbancia del indicador rojo neutro en varios búferes. La forma protonada del rojo neutro es el rojo, y la forma desprotonada es el amarillo-naranja, lo que significa que absorben la luz verde y azul-violeta, respectivamente. Por lo tanto, las formas ácida y básica tienen distintas longitudes de onda de absorción. La unión a proteínas altera las propiedades del rojo neutro, cambiando tanto su absorbancia como su pKa.
Después de medir el espectro de absorbancia del rojo neutro libre a varios valores de pH, agregará la proteína de unión a riboflavina, o RP, a las soluciones y medirá las absorbancias nuevamente. La intensidad de la absorbancia está relacionada con la concentración, por lo que utilizará los espectros para determinar el pKa del rojo neutro libre y unido después del laboratorio.
| Cubeta # | Tampón pH | Abs. at λmax (Libre NRH+) | Abs. at λmax (Bound NRH) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | en blanco |
Ahora, analicemos nuestros datos de absorbancia para determinar los pKa del rojo neutro.
| NRH+ gratis | Enlazado NRH+ | |
| λmáx. (nm) | ||
| ΔA (nm) | ||
| Punto medio (nm) | ||
| pKa |
Haga clic aquí para descargar la Tabla 3
En la primera parte de este experimento, preparará una solución de fosfato de sodio tamponada a pH 7.0. El fosfato monosódico es un ácido débil con la base conjugada fosfato disódico. Las soluciones de fosfato monosódico no ajustado suelen tener un pH de aproximadamente 4 a 6.
Los tampones son más efectivos cerca de su pKa, que es de 6,8 a 7,2 para el fosfato monosódico. Por lo tanto, utilizará hidróxido de sodio para empujar el equilibrio hacia la base conjugada sin alterar la composición general del equilibrio del tampón. Antes de comenzar el laboratorio, calcule la masa de fosfato monosódico que necesitará para hacer 200 mililitros de una solución de 50 milimolares.
Esta sección del laboratorio utiliza hidróxido de sodio, que es corrosivo y tóxico. Tenga cuidado al verter y transportar hidróxido de sodio. Ahora, comencemos.
Primero, póngase una bata de laboratorio, gafas de seguridad resistentes a salpicaduras y guantes de nitrilo. A continuación, llene una botella de lavado de plástico de 250 mililitros con agua desionizada. Etiquete dos vasos de precipitados de 100 mililitros para residuos acuosos neutros y básicos, respectivamente.
A continuación, calibra tu medidor de pH utilizando los tampones proporcionados. Guarde la sonda en su solución de almacenamiento cuando haya terminado. Ahora, lleva un vaso de precipitados de 400 mililitros a la zona de balanza analítica para obtener el fosfato monosódico que necesitarás.
Tara un pedazo de papel de pesaje y usa una espátula limpia para medir la cantidad requerida de fosfato monosódico de acuerdo con tus cálculos. El fosfato monosódico absorbe la humedad del aire, así que trabaje rápidamente para obtener una medición precisa y cierre bien el recipiente cuando haya terminado con él. Registre la cantidad exacta de fosfato monosódico que mide en su cuaderno de laboratorio.
A continuación, coloque el fosfato monosódico en el vaso de precipitados y limpie la espátula con una toallita de laboratorio. Deseche el papel de pesaje y la toallita de laboratorio antes de volver a la campana extractora. Ahora, use un cilindro graduado para medir 175 mililitros de agua desionizada.
Vierta el agua en el vaso de precipitados de fosfato monosódico y agregue una barra magnética para agitar. Revuelva la solución en una placa para remover hasta que la sal se haya disuelto por completo y la solución parezca homogénea. Esto suele tardar de dos a tres minutos.
Luego, mida 15 mililitros de agua desionizada con un cilindro graduado. Vierta el agua desionizada en el vaso de precipitados y continúe removiendo la solución hasta que vuelva a parecer homogénea, lo que suele tardar de uno a dos minutos. Luego, apague el motor de agitación.
Enjuague la sonda de pH con agua desionizada y luego sujétela en la solución con el sensor sobre la barra agitadora. Ahora, lleve un cilindro graduado de 10 mililitros y un vidrio de reloj a la campana dispensadora, y mida 10 mililitros de hidróxido de sodio 1 molar. Cubra el hidróxido de sodio con el cristal del reloj y llévelo con cuidado a la campana extractora.
Anote el volumen exacto en el cilindro graduado. Luego, reanude la agitación de la solución de fosfato monosódico. Mientras controla la lectura del pH, use una pipeta desechable para agregar lentamente hidróxido de sodio a la solución de agitación gota a gota.
Una vez que el pH del tampón alcance 7,0, devuelva el hidróxido de sodio que aún esté en la pipeta al cilindro graduado. Luego, calcule el volumen de hidróxido de sodio que agregó a partir de los volúmenes inicial y final en el cilindro graduado. Reste ese volumen de 10 mililitros para determinar la cantidad de agua desionizada que debe agregar a su tampón para alcanzar un volumen total de solución de 200 mililitros.
Mide el agua desionizada que necesites con otro cilindro graduado de 10 mililitros y añádelo a la solución de agitación para terminar de hacer el tampón. Enjuague el sensor de pH con agua desionizada, cúbralo con la tapa llena de solución de almacenamiento y desconecte o apague la sonda. Después de eso, etiquete una botella de polietileno de 250 mililitros como tampón de fosfato monosódico de 50 milimolares, pH 7.0'Use pinzas para recuperar la barra de agitación magnética de la solución.
Luego, coloque un embudo en la boca de la botella y vierta la solución tampón en la botella. Retire el embudo y tape bien la botella. Ahora está listo para pasar a la sección de espectroscopia de absorción.
Los tampones se pueden utilizar para evaluar compuestos a valores de pH específicos. En esta sección, registrará el espectro de absorbancia del indicador rojo neutro en varios búferes. La forma protonada del rojo neutro es el rojo, y la forma desprotonada es el amarillo-naranja, lo que significa que absorben la luz verde y azul-violeta, respectivamente.
Por lo tanto, las formas ácida y básica tienen distintas longitudes de onda de absorción. La unión a proteínas altera las propiedades del rojo neutro, cambiando tanto su absorbancia como su pKa. Después de medir el espectro de absorbancia del rojo neutro libre a varios valores de pH, agregará la proteína de unión a riboflavina, o RP, a las soluciones y medirá las absorbancias nuevamente.
La intensidad de la absorbancia está relacionada con la concentración, por lo que utilizará los espectros para determinar el pKa del rojo neutro libre y unido después del laboratorio. Antes de comenzar esta sección, dibuje una tabla en su cuaderno de laboratorio, enumere el número de cubeta, el pH del tampón, la absorbancia en lambda max para el rojo neutro protonado libre y la absorbancia en lambda max para el rojo neutro protonado unido. Numere las cubetas del 1 al 10 y haga una lista de los nueve valores de pH del tampón que utilizará.
La 10ª cubeta será una mina de agua desionizada. Sujete siempre las cubetas por los lados texturizados y limpie los lados transparentes justo antes de colocar la cubeta en el espectrofotómetro. Recuerde alinear los lados transparentes con el haz de luz del espectrofotómetro.
Ahora, comencemos. Consigue diez cubetas y tapas de 1,5 mililitros, y etiqueta las tapas del 1 al 10 para que coincidan con la tabla de tu cuaderno de laboratorio. Etiquete un vaso de precipitados de 25 mililitros como DIH2O' y llénelo con agua desionizada.
A continuación, tire los residuos acuosos neutros por el desagüe y vuelva a etiquetar el vaso de precipitados como residuos acuosos tampón'Además, etiquete un vaso de precipitados de 400 mililitros para las puntas de micropipeta usadas. A continuación, conecte una punta a una micropipeta de 1 mililitro y utilícela para dispensar 1000 microlitros de agua desionizada en la cubeta 10. Este será su disolvente en blanco.
Ahora, expulse la punta, configure la micropipeta para dispensar 925 microlitros y coloque una nueva punta. Coloque 925 microlitros de su tampón de fosfato monosódico pH 7.0 en la cubeta cinco. Expulse la punta y tape la cubeta.
A continuación, lleve las cubetas vacías restantes a la mesa intermedia. Guiado por la tabla de su cuaderno de laboratorio, dispense 925 microlitros de cada tampón en la cubeta adecuada utilizando las micropipetas etiquetadas. Tenga cuidado de no utilizar la misma punta de pipeta para diferentes tampones.
Una vez que haya terminado, lleve los tampones a su banco de trabajo. Allí, configure una micropipeta de 200 microlitros para dispensar 75 microlitros y coloque una punta en la micropipeta. Ahora, obtenga un frasco o tubo de solución roja neutra, que puede compartir con otro grupo de estudiantes.
Dispense 75 microlitros de rojo neutro en cada una de las nueve cubetas tampón. Sustituya la punta de la pipeta si entra en contacto con un tampón. Expulse la punta de la pipeta y tape las cubetas cuando termine.
Ahora, invierta cada cubeta varias veces para mezclar bien las soluciones. Una vez que hayas mezclado el rojo neutro con cada tampón, toma una foto o escribe los colores de las soluciones. A continuación, encienda un espectrofotómetro de mano y espere a que la fuente de luz se caliente.
Una vez que esté listo, cree un nuevo experimento para medir la absorbancia frente a la longitud de onda para el rojo neutro libre. Luego, inserte la cubeta de agua desionizada. Adquiera un espectro del agua desionizada y configúrelo como un fondo solvente o en blanco.
Luego, retire el blanco del espectrofotómetro e inserte la cubeta de rojo neutro en el tampón de pH más bajo, que tendrá la concentración más alta de rojo neutro protonado. Adquiera un espectro, que debe mostrar un pico fuerte. Identifique la longitud de onda correspondiente al punto más alto de este pico, o el máximo.
Registre esta longitud de onda en su cuaderno de laboratorio como lambda max para el rojo neutro libre protonado. Guarde los datos y retire la cubeta. Registre la absorbancia en su cuaderno y luego recopile los espectros de las cubetas 2 a 9 utilizando el mismo procedimiento.
Todos los espectros deben cruzarse en un solo punto, llamado punto isosbólico. Registre la longitud de onda de este punto en su cuaderno de laboratorio. Si un espectro no se cruza en ese punto, vacíe y limpie la cubeta, prepare una muestra nueva y vuelva a intentarlo.
Una vez que termine de recopilar los espectros de las 9 cubetas, guarde y exporte los datos. A continuación, cree un nuevo experimento para medir la absorbancia en función de la longitud de onda del rojo neutro ligado. Coloque una nueva punta en la micropipeta de 200 microlitros y obtenga un recipiente compartido de proteína de unión a riboflavina.
Agregue 75 microlitros de solución de proteína de unión a riboflavina a cada cubeta, incluida la pieza en blanco. Expulse la punta, asegure las tapas de la cubeta e invierta la cubeta varias veces para mezclar las soluciones. Ahora, inserte la cubeta 10 en el espectrofotómetro y configúrela como disolvente en blanco.
A continuación, adquiera un espectro de la muestra de pH más baja e identifique la longitud de onda correspondiente al máximo del pico más intenso. Regístrelo en su cuaderno de laboratorio como lambda max de rojo neutro ligado a protonado. Después de eso, adquiera espectros para las cubetas 2 a 9 de la misma manera que lo hizo para las muestras gratuitas de rojo neutro.
Registre las intensidades en lambda max para el rojo neutro ligado a protones en su tabla, junto con la longitud de onda en el punto isosbónico. Cuando haya terminado, guarde sus datos, expórtelos para su posterior análisis y apague el espectrofotómetro. Guarde las micropipetas, las cajas de puntas, el medidor de pH y el espectrofotómetro.
Deseche las puntas de pipeta usadas en un contenedor de residuos o en un cubo de basura autorizado. Ahora, vacíe las cubetas en el vaso de precipitados de residuos tampón acuoso y enjuague las cubetas en el vaso de precipitados con agua desionizada. En su campana extractora, vacíe el exceso de hidróxido de sodio en el residuo básico y enjuague el cilindro graduado con agua.
Tira los residuos acuosos básicos por el desagüe con abundante agua del grifo, junto con los demás residuos acuosos. Lave la cristalería, las tapas de las cubetas y la barra agitadora según los procedimientos estándar de su laboratorio. Por último, limpie sus superficies de trabajo con una toalla de papel húmeda y deseche las toallas de papel y las toallitas de laboratorio usadas en la papelera del laboratorio.
Ahora, analicemos nuestros datos de absorbancia para determinar los pKa del rojo neutro. En primer lugar, represente ambos conjuntos de datos de intensidad con la intensidad de absorbancia en lambda máx. en el eje y y el pH en el eje x, con los puntos unidos por líneas suaves. A continuación, para cada serie de datos, calcule la diferencia entre las intensidades de absorbancia inicial y final.
Utilícelo para calcular la absorbancia a medio camino entre las absorbancias inicial y final de cada serie, o los puntos medios de absorbancia. Ahora, encuentre dónde se encuentra el punto medio en cada línea e identifique el valor de pH en ese punto. Estos valores de pH son los pKa del rojo neutro libre y unido.
Aquí, vemos un aumento en pKa de aproximadamente 1 entre el rojo neutro libre y unido, lo que indica que el rojo neutro protonado unido es un ácido más débil que el rojo neutro protonado libre en un orden de magnitud.
