Fraccionamiento subcelular

El homogeneizado obtenido después de la lisis celular contiene varios orgánulos unidos a membranas que pueden separarse en fracciones puras mediante fraccionamiento subcelular. Estos aislados se utilizan para estudiar componentes celulares específicos, analizar la actividad proteica localizada e incluso se emplean en diagnóstico. El fraccionamiento generalmente se logra mediante métodos de centrifugación, siendo los más comunes la centrifugación por gradiente de densidad y la centrifugación diferencial.

Centrifugación diferencial

La centrifugación diferencial es un método relativamente simple que separa los componentes celulares según su tamaño y densidad. La centrifugación secuencial con velocidades crecientes (que van desde 10.000 x ga 150.000 x g) sedimenta los componentes de diferentes tamaños. Sin embargo, dado que varios orgánulos pueden tener un tamaño y densidad similares, este método suele producir fracciones crudas.

Centrifugación en gradiente de densidad:

Se pueden obtener fracciones altamente purificadas de componentes celulares separando el homogeneizado en una solución de gradiente de densidad. Se prepara un gradiente de densidad en un tubo de centrífuga colocando soluciones con densidades crecientes, como soluciones de sacarosa cada vez más concentradas, con la capa más densa en el fondo del tubo. Estos gradientes se utilizan en la centrifugación zonal para separar orgánulos celulares en función de su tamaño y forma. Tras la centrifugación, los orgánulos sedimentan a diferentes velocidades, según sus coeficientes de sedimentación, a medida que se mueven a través de las diferentes capas de densidad.

Como alternativa, también se puede preparar un gradiente de densidad continuo mezclando soluciones de diferentes densidades en proporciones graduales a lo largo del tubo. Durante la centrifugación, cada componente se inmoviliza en la posición que coincide con su densidad: su posición de equilibrio. De ahí que este método también se conozca como equilibrio o sedimentación flotante. Esta separación de componentes celulares y moléculas se basa, por tanto, en su densidad, no en su tamaño.