32.6
El fraccionamiento subcelular se utiliza para obtener fracciones puras de diferentes orgánulos celulares a partir de un lisado celular.
Dos métodos comúnmente utilizados para el fraccionamiento subcelular son la centrifugación diferencial y la centrifugación en gradiente de densidad.
La centrifugación diferencial utiliza la centrifugación secuencial a velocidades progresivamente crecientes para la separación de orgánulos basada en el tamaño.
En primer lugar, la muestra se centrifuga a una velocidad baja de alrededor de 400 a 600 x g para sedimentar estructuras grandes como núcleos y restos celulares.
Luego, el sobrenadante se hace girar a alta velocidad que oscila entre 10.000 y 20.000 x g para pellizar orgánulos como mitocondrias, lisosomas y peroxisomas.
Otros ciclos de centrifugación a velocidades superiores a 80.000 x g pueden separar microsomas, fracciones de membrana e incluso ribosomas.
Sin embargo, la centrifugación diferencial no puede separar los orgánulos que son muy cercanos en tamaño o densidad, como las mitocondrias, de los peroxisomas.
En tales casos, la centrifugación en gradiente de densidad, un método más sensible, es una herramienta valiosa.
Este método utiliza gradientes de densidad establecidos mediante productos químicos
como la sacarosa o el glicerol para separar orgánulos en capas distintas según el tamaño, la forma o la densidad dentro de un solo tubo.
El homogeneizado obtenido después de la lisis celular contiene varios orgánulos unidos a membranas que pueden separarse en fracciones puras mediante fraccionamiento subcelular. Estos aislados se utilizan para estudiar componentes celulares específicos, analizar la actividad proteica localizada e incluso se emplean en diagnóstico. El fraccionamiento generalmente se logra mediante métodos de centrifugación, siendo los más comunes la centrifugación por gradiente de densidad y la centrifugación diferencial.
Centrifugación diferencial
La centrifugación diferencial es un método relativamente simple que separa los componentes celulares según su tamaño y densidad. La centrifugación secuencial con velocidades crecientes (que van desde 10.000 x ga 150.000 x g) sedimenta los componentes de diferentes tamaños. Sin embargo, dado que varios orgánulos pueden tener un tamaño y densidad similares, este método suele producir fracciones crudas.
Centrifugación en gradiente de densidad:
Se pueden obtener fracciones altamente purificadas de componentes celulares separando el homogeneizado en una solución de gradiente de densidad. Se prepara un gradiente de densidad en un tubo de centrífuga colocando soluciones con densidades crecientes, como soluciones de sacarosa cada vez más concentradas, con la capa más densa en el fondo del tubo. Estos gradientes se utilizan en la centrifugación zonal para separar orgánulos celulares en función de su tamaño y forma. Tras la centrifugación, los orgánulos sedimentan a diferentes velocidades, según sus coeficientes de sedimentación, a medida que se mueven a través de las diferentes capas de densidad.
Como alternativa, también se puede preparar un gradiente de densidad continuo mezclando soluciones de diferentes densidades en proporciones graduales a lo largo del tubo. Durante la centrifugación, cada componente se inmoviliza en la posición que coincide con su densidad: su posición de equilibrio. De ahí que este método también se conozca como equilibrio o sedimentación flotante. Esta separación de componentes celulares y moléculas se basa, por tanto, en su densidad, no en su tamaño.
El fraccionamiento subcelular se utiliza para obtener fracciones puras de diferentes orgánulos celulares a partir de un lisado celular.
Dos métodos comúnmente utilizados para el fraccionamiento subcelular son la centrifugación diferencial y la centrifugación en gradiente de densidad.
La centrifugación diferencial utiliza la centrifugación secuencial a velocidades progresivamente crecientes para la separación de orgánulos basada en el tamaño.
En primer lugar, la muestra se centrifuga a una velocidad baja de alrededor de 400 a 600 x g para sedimentar estructuras grandes como núcleos y restos celulares.
Luego, el sobrenadante se hace girar a alta velocidad que oscila entre 10.000 y 20.000 x g para pellizar orgánulos como mitocondrias, lisosomas y peroxisomas.
Otros ciclos de centrifugación a velocidades superiores a 80.000 x g pueden separar microsomas, fracciones de membrana e incluso ribosomas.
Sin embargo, la centrifugación diferencial no puede separar los orgánulos que son muy cercanos en tamaño o densidad, como las mitocondrias, de los peroxisomas.
En tales casos, la centrifugación en gradiente de densidad, un método más sensible, es una herramienta valiosa.
Este método utiliza gradientes de densidad establecidos mediante productos químicos
como la sacarosa o el glicerol para separar orgánulos en capas distintas según el tamaño, la forma o la densidad dentro de un solo tubo.
From Chapter 32:
Now Playing
Análisis de células y proteínas
7.9K Views
Análisis de células y proteínas
6.0K Views
Análisis de células y proteínas
17.7K Views
Análisis de células y proteínas
8.5K Views
Análisis de células y proteínas
13.7K Views
Análisis de células y proteínas
9.2K Views
Análisis de células y proteínas
14.0K Views
Análisis de células y proteínas
7.7K Views
Análisis de células y proteínas
11.1K Views
Análisis de células y proteínas
6.5K Views
Análisis de células y proteínas
6.5K Views
Análisis de células y proteínas
24.6K Views
Análisis de células y proteínas
15.6K Views
Análisis de células y proteínas
6.6K Views
Análisis de células y proteínas
14.5K Views
See More