33.4: Microscopía de inmunofluorescencia

Un microscopio de fluorescencia utiliza cromóforos fluorescentes llamados fluorocromos, que pueden absorber energía de una fuente de luz y luego emitir esta energía como luz visible. Los fluorocromos incluyen sustancias naturalmente fluorescentes (como las clorofilas) y tinciones fluorescentes que se agregan a la muestra para crear contraste. Tintes como el rojo de Texas y el FITC son ejemplos de fluorocromos. Otros ejemplos incluyen los colorantes de ácido nucleico 4′,6′-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y naranja de acridina.

El microscopio irradia la muestra con excitación de longitud de onda corta, como luz ultravioleta o azul. Los cromóforos absorben la luz de excitación y emiten luz visible de longitudes de onda más largas. Luego, la luz de excitación se filtra (en parte porque la luz ultravioleta es dañina para los ojos) para que solo la luz visible pase a través del cristalino ocular, produciendo una imagen del espécimen en colores brillantes sobre un fondo oscuro.

Los microscopios de fluorescencia pueden identificar patógenos, encontrar especies particulares dentro de un entorno o encontrar la ubicación de moléculas y estructuras particulares dentro de una célula. También se han desarrollado enfoques para distinguir las células vivas de las muertas en función de si absorben fluorocromos particulares. A veces, se utilizan varios fluorocromos en la misma muestra para mostrar diferentes estructuras o características.

Una de las aplicaciones más importantes de la microscopía de fluorescencia es la inmunofluorescencia, que se utiliza para identificar ciertos microbios observando si los anticuerpos se unen a ellos. (Los anticuerpos son moléculas de proteínas que produce el sistema inmunitario y que se adhieren a patógenos específicos para matarlos o inhibirlos). Esta técnica tiene dos enfoques: ensayo de inmunofluorescencia directa (DFA) y ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA). En la DFA, los anticuerpos específicos (por ejemplo, los que se dirigen al virus de la rabia) se tiñen con un fluorocromo. Si la muestra contiene el patógeno objetivo, se pueden observar los anticuerpos que se unen al patógeno bajo el microscopio fluorescente. Esta es una tinción de anticuerpos primario porque los anticuerpos teñidos se adhieren directamente al patógeno.

En el IFA, los anticuerpos secundarios se tiñen con un fluorocromo en lugar de anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios no se adhieren directamente al organismo, sino que se unen a los anticuerpos primarios. Cuando los anticuerpos primarios no teñidos se unen al patógeno, se puede observar que los anticuerpos secundarios fluorescentes se unen a los anticuerpos primarios. Por lo tanto, los anticuerpos secundarios se unen indirectamente al patógeno. Dado que a menudo se pueden unir múltiples anticuerpos secundarios a un anticuerpo primario, el IFA aumenta el número de anticuerpos fluorescentes unidos a la muestra, lo que facilita la visualización de sus características.