Impresión por microcontacto se utiliza ampliamente a las proteínas de patrones y otras moléculas en las superficies de material. Se demuestra los pasos básicos de este proceso, los patrones de estampación de la fibronectina sobre el cristal.
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Artículo de método
Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular
En este artículo
Resumen
Resumen
Protocolo
1. Preparación de soluciones y materiales
Estos pasos deben llevarse a cabo de varios días de antelación.
- Cubreobjetos de vidrio. Cubreobjetos fueron limpiados por inmersión durante 10 minutos en una solución de detergente Linbro 7X: agua, mezclado en una relación 1: 3 relación y se calienta con agitación hasta que se aclare. Cubreobjetos se lavaron exhaustivamente con agua destilada, y luego se hornea a 450 ° C durante 6 horas. Cargando cubreobjetos en bastidores tinción de cerámica (ver reactivos) simplifica este proceso.
- Proteína solución para la estampación. Reconstituir la fibronectina siguiendo las instrucciones de los fabricantes una solución madre de 1 mg / ml de concentración.
2. Fundido sellos del maestro topológica
Estos pasos pueden llevarse a cabo de varios días de antelación. Sellos tienda de patrones en un plato cubierto, como una placa de cultivo de tejidos.
- Quite el polvo del maestro por medio de una corriente de aire comprimido, aire filtrado o gas inerte.
- Coloque el maestro, con dibujos laterales arriba, en el fondo de un plato de plástico apenas más grande que el maestro. 60 - o 100 mm de placas de cultivo de tejidos son muy adecuadas para este propósito.
- En un tubo de poliestireno de centrífuga de 50 ml, se combinan los componentes Sylgard en una proporción de agente de curado: base de elastómero de 1: 10 en peso. Mezcle bien con un dispositivo de plástico, como una pipeta desechable. Preparar al menos 0,2 ml de elastómero por centímetro cuadrado de área de plato.
- Centrifugar el tubo de 50 ml a 300 g durante 5 min para eliminar las burbujas de aire.
- Vierta el elastómero sobre el maestro, y luego colocarlo en un secador, al vacío, durante 30 minutos.
- Curar el elastómero en un horno a 65 ° C durante al menos 2 horas. Curado a temperaturas más altas y durante más tiempo los resultados en tiempos más rígido elastómero. Deje que se enfríe a temperatura ambiente.
- Separar la hoja de sellos del maestro.
3. Microcontacto de impresión de la fibronectina sobre vidrio
- Corte un único sello. Sellos de medición de 4 mm x 4 mm a 1 cm x 1 cm en la zona y 1 a 2 mm de espesor son más fáciles de empezar. Ponga el lado patrón de arriba en un portaobjetos de cristal o de plástico.
- Coloque el sello en un limpiador de plasma, y el proceso, al vacío, durante 30 segundos. Un limpiador de plasma Harrick Científico (ver equipos), establece en su valor más alto de salida hará que la superficie hidrofílica PDMS. Ya veces provocar el agrietamiento del elastómero.
- Diluir la solución de fibronectina con agua desionizada a una concentración de estampación de 50 ug / ml.
- Coloque una pequeña gota (10 - 50 l) de solución de estampado en el sello. Se extenderá por todo la superficie hidrófila. Agregar suficiente solución única que cubre la caída de la marca, pero no se ejecuta en los bordes. Vamos a absorber las proteínas para acabar por 5 minutos.
- El uso de un Kimwipe ® u otro tejido de papel limpia, la mecha de la mayor parte de la solución de proteína de la marca, sin tocar la región con patrón.
- Seque el resto de la solución de la marca bajo un chorro de agua limpia, el gas seco e inerte como el nitrógeno.
- Con unas pinzas, retire el sello de la lámina de vidrio, invertir, y el lugar en contacto con el cubreobjetos limpio (la superficie a rellenar con patrón). Colocar un peso encima para promover un buen contacto. El peso específico que proporciona el mejor patrón depende del tamaño de la estampilla y el patrón, empieza con un peso de 5 g, y ajuste entre piezas estampadas. Deje el sello en contacto con la superficie de un minuto.
- Con cuidado, desmontar la pila, y el sello independiente de cubreobjetos.
- Enjuague vigorosamente el cubreobjetos con dibujos en PBS, seguido de agua destilada, para eliminar la proteína que no se adsorbe a la superficie. Cubreobjetos seca en corriente de nitrógeno.
Resultados representante
Impresión por microcontacto es un proceso de gran alcance para las moléculas de los patrones en las superficies. Este proceso tiene la capacidad de crear funciones con dimensiones que van desde decenas de micrómetros a cientos de nanómetros, en la figura. 1A, los logotipos de la izquierda son cada 200 m de altura, mientras que las manchas verdes se ilustra en la figura. 1B son: 1 m de diámetro y espaciados a intervalos de 4 m, medidos de centro a centro. Fig. 1B también ilustra una propiedad de gran alcance de impresión por microcontacto, es decir, que es y el proceso aditivo. Múltiples rondas de impresión por microcontacto se puede aplicar a una sola superficie para crear sistemas multicomponentes 3.
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Discusión
El proceso de impresión por microcontacto es conceptualmente simple y muy robusto, que se ha aplicado a los patrones de una amplia gama de moléculas en una variedad de sustratos. Sin embargo, este proceso sigue siendo algo de un arte. La geometría específica del modelo que se creó, la proteína a ser modelado, el peso aplicado, y el recubrimiento / sellado todas las condiciones de afectar la calidad de estampado. Por ejemplo, poco peso, aplicada a grandes rasgos, a menudo resulta en diferencias en el patrón como se puede ver en el logo super...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Limpieza de plasma | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desecador | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reactivo | Invitrogen | 10010-072 | |
| Kit de etiquetado de proteínas | Reactivo | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectina | Reactivo | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Portapocillos para tinción | Reactivo | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cubreobjetos | Reactivo | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reactivo | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Rejilla de difracción | Reactivo | Edmund Scientific | 3040267 |
Referencias
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
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Reimpresiones y permisos
