Drosophila larval NMJ Disección

Resumen

Este protocolo muestra cómo diseccionar Drosophila Larvas en la preparación de inmunohistoquímica y / o imágenes de la unión neuromuscular.

Protocolo

Antes de empezar

1. Todas las culturas deben ser cultivadas a 25 ° C.
2. HL3.1 buffer disección puede ser preparado de antemano. Tomar una alícuota de 50 ml de HL3.1 y mantener en hielo.
3. Prepare 15 ml de formaldehído fresco 3,5% en HL3.1. Mantenga en hielo.

Disección de larvas

1. Ponga una gota de frío HL3.1 en la placa de disección. Esto evitará que el animal se seque y aturdir al animal por lo que es más fácil trabajar con.
2. Usando las pinzas largas, seleccione una larva de tercer estadio errantes y colocarlo en la caída de HL3.1.
3. En primer lugar, el uso de fórceps corto para captar un alfiler minutien. Coloque el pasador entre los espiráculos posteriores. Los animales por lo general tratan de arrastrarme de la clavija se extiende hacia fuera y lo que es más fácil para que usted ponga un alfiler de lleno en la cabeza de la larva cerca de los ganchos de la boca. Tramo al animal a lo largo. Esto le ayudará a maximizar la cantidad de la pared expuesta del cuerpo se puede lograr durante el corte. Nota: Si usted decide echar la cabeza, el animal puede envolver su cuerpo alrededor de la clavija o el látigo de su cuerpo hacia atrás y adelante por lo que es difícil de precisar. Por lo general, se puede contrarrestar esta quitando el HL3.1 y colocar una gota fría impresionante fresco del animal una vez más. El científico ambidiestro también acaba de agarrar al animal y mantenerlo en su lugar.
4. Con la tijera de primavera hacer una incisión horizontal justo anterior a la posterior pin en la parte dorsal de la larva. Coloque una hoja de la tijera en la incisión y realizar un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal hacia el extremo rostral de la larva. En la tribuna de los animales hacen incisiones horizontales a la izquierda ya la derecha del pasador. Nota: el resultado final debe ser similar a uno que en la parte dorsal de la larva en el eje rostrocaudal.
5. Extraer los órganos. Comience por poner varias gotas adicionales de HL3.1 en la larva. Esto permitirá a los órganos de flotar fuera del cuerpo, lo que le permite eliminar con mayor facilidad. En primer lugar, eliminar el sistema traqueal. En segundo lugar, utilizar las pinzas para agarrar el resto de los órganos y eliminarlos.
6. Durante el paso 3 se hizo una aleta izquierda y la aleta derecha en la pared del cuerpo. Pin los flaps en un fin de asegurarse de que las agujas del reloj para estirar la pared del cuerpo, tanto horizontales como verticales.

Fijación

Fijar cada animal en el 3,5% de formaldehído en HL3.1 durante 25 minutos. Lave al animal dos veces en HL3.1 durante 5 minutos.

Almacenamiento

Retire los pernos y la transferencia de las larvas a un tubo de 1.5 ml contiene 1X PBS. Si va a utilizar la imagen de la UNM fundido etiquetas fluorescentes, se debe la imagen de los animales en dos días. Puede almacenar las larvas disecadas de hasta una semana a 4 ° C.

Los resultados representativos

Hay varios componentes clave para una adecuada disección larvas de Drosophila. En primer lugar, hay que tener cuidado de no dañar los músculos, especialmente los músculos de 4, 6 y 7. Estos son los músculos más popular para el estudio y si se dañan descartar la preparación de filetes y diseccionar a otro animal. En segundo lugar, hay que asegurarse de que el animal está al máximo se extendía de manera que cada músculo y la UNM se pueden distinguir.

Discusión

La técnica de disección se demuestra en este vídeo se puede utilizar para preparar a las larvas de Drosophila para una variedad de técnicas experimentales. Si las etiquetas fluorescentes de proteínas están presentes, las larvas pueden ser montados y la imagen de inmediato. De lo contrario, la inmunotinción se puede realizar con el fin de marca específica compartimentos sináptica. Además, la electrofisiología se puede realizar fácilmente en las larvas disecados para evaluar el funcionamiento de la neurotransmisi...

Materiales

HL3 disección Buffer: (en mm) 70 NaCl, 5 KCl, CaCl2 0,2, MgCl2 20, 10 NaHCO3, 5 trehalosa, sacarosa 115, y HEPES 5, pH 7,3.
Sylgard disección de la placa: Mezclar suavemente (para evitar burbujas) de 10:1 en un vaso de precipitados. Vierta la mezcla en placa de Petri (de cualquier tamaño). Permitir Sylgard curar toda la noche en 37 ° C incubadora.