De gran volumen (20 litros +) Filtración de muestras de agua marina costera

Resumen

Este volumen de vídeo documentos de gran tamaño (≥ 20 L) de filtración de la biomasa microbiana, que oscilan entre 0.22μm y 2.7μm de diámetro, desde la columna de agua.

Resumen

El flujo de trabajo comienza con la recolección de las aguas marinas costeras de la comunidad microbiana abajo, análisis de gases en nutrientes y oligoelementos. Para este método, se recogieron muestras de la cubierta de la operación HMS John Strickland en Saanich Inlet. Este volumen de vídeo documentos de gran tamaño (≥ 20 L) de filtración de la biomasa microbiana, que oscilan entre 0.22μm y 2.7μm de diámetro, desde la columna de agua. Dos muestras de 20 litros se pueden filtrar de forma simultánea utilizando una unidad de una sola bomba equipada con cuatro cabezales rotativos. La filtración se lleva a cabo en el campo de los viajes largos, o inmediatamente después del regreso de excursiones de un día. Es importante registrar la cantidad de agua que pasa por cada unidad sterivex filtro. Para prevenir la formación de biofilm entre los viajes de muestreo, todo el equipo de filtración debe ser enjuagado con HCl diluido y agua destilada y autoclave inmediatamente después del uso. Este procedimiento durará aproximadamente cinco horas más una hora adicional para la limpieza.

Protocolo

1. Puesta en marcha de aparatos de filtración
   1. Para configurar el equipo de filtración, use pinzas para colocar un grado GF / D de filtro en la unidad de vivienda pre-filtro. Apriete ligeramente la carcasa con la mano. Como regla general, no apretar en exceso o de la unidad se fuga una vez que se inicia el bombeo.
   2. Vuelva a colocar la tapa de la bombona con la tapa del autoclave y tubos conectados por cuidado de insertar el tubo interno en la bombona, pero sin tocarlo. Si es necesario, use pinzas para guiar el tubo en la garrafa.
   3. Pase la tubería externa a través de la bomba peristáltica.
   4. Colocar las unidades de vivienda prefiltro hasta el final de los dos tubos externos (es decir, 2 unidades por bombona). Apriete la conexión con los alicates.
2. Filtración de agua de mar
   1. Para empezar a filtrar el agua de mar, a su vez en la bomba y ajustar la velocidad de flujo a 1. Reloj para asegurar que el agua se bombea en la dirección correcta.
   2. Permita que 500 ml de agua a fluir libremente a través de la unidad de pre-filtro y en un vaso de 1 litro.
   3. Apague la bomba y coloque un filtro Sterivex a la conexión luer macho en el extremo libre de la configuración del prefiltro. Apriete el prefiltro de la vivienda cómodamente con la mano.
   4. Esté atento a la vivienda en el prefiltro y la conexión entre la vivienda pre-filtro y el tubo que conduce a la bombona. Si se producen fugas, apagar la bomba y aflojar y apretar la cubierta prefiltro en consecuencia. Encienda la bomba de nuevo.
   5. Recoger el filtrado en 4 frascos L. Una vez que se llena y vacía los frascos en una bombona de limpieza. Asegúrese de anotar el volumen pasa a través de cada filtro. Recogidos filtrado pueden ser procesados, tales como la filtración de virus.
   6. Continuar el filtrado hasta que no quede agua en el bombonas. Filtración habitual gama veces entre 4-5 h / 20 bombona L, sin embargo, esto depende de manera dramática en la cantidad de biomasa en el agua.
   7. Una vez que la filtración se haya completado, el interruptor de la bomba y desconecte el filtro Sterivex.
3. El almacenamiento de filtros
   1. Para almacenar los filtros, en primer lugar expulsar cualquier resto de agua con una jeringa de 30-60.
   2. Con una pipeta, añadir 1,8 ml de solución amortiguadora de lisis del filtro, manteniendo ~ 200 ul de espacio en el filtro para la adición posterior de los reactivos.
   3. Selle la parte inferior y superior del filtro Sterivex con un pequeño trozo de Parafilm, y la etiqueta de los filtros con la fecha y la identificación de la muestra.
   4. Tienda de los filtros en un pre-etiquetados tubo Falcon de 50 ml a -80 ° C
   5. Retire los filtros de la unidad de vivienda y colocarlos en un recipiente etiquetado tubos Falcon de 50 ml que contiene 2 ml de tampón de lisis. Guarde estos documentos a -80 ° C.
4. Limpieza
   1. Para la limpieza final, coloque el tubo que estaba dentro de la bombona en un matraz que contenía 0,1 M de HCl
   2. Dirigir la tubería que conducen al matraz 4L en la bombona original.
   3. Encienda la bomba y correr a los 3, recogiendo el flujo a través de carreras en la bombona original.
   4. Por último, enjuagar la tubería con agua esterilizada.

Los resultados representativos: El resultado final consiste en dos filtros Sterivix cada uno con la biomasa microbiana del agua de mar de aproximadamente 10 L en el rango de tamaño de 0.22μm y 2.7μm. Esto se almacena en buffer de lisis y listo para la extracción de ADN. Además, este procedimiento se acumula y concentra la biomasa superior a 2,7 micras, en los prefiltros GF / D. Esto también se almacena en buffer de lisis y listo para la extracción de ADN. Si los pasos de procesamiento adicionales se toman, el 0,22 M a través de flujo se pueden concentrar hasta recoger la fracción viral también.

Discusión

Es imprescindible para limpiar los bancos y las bombas con una toalla húmeda después de cada uso para eliminar cualquier rastro persistente de agua salada que de otra manera corroer el equipo. Aunque el procedimiento es simple, el tiempo requerido puede ser extensa en función de la concentración de la biomasa o los residuos de la muestra que se filtra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bomba peristáltica		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tubo Tygon LFL		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	Para el aparato de filtración
Abrazaderas para manguera		Cole-Parmer	0683204	Para el aparato de filtración
Adaptadores de tubería de 1/4” x 3/16”		Cole-Parmer	31702-20	Para el aparato de filtración
Carcasa de prefiltro de polipropileno		ADVANTEC	501200	Para el aparato de filtración
Conector metálico luer (extremo de manguera a luer macho con bloqueo)		Cole-Parmer	31507-27	Para el aparato de filtración
Imanes de 2“			Para el aparato de filtración
Tapas de garrafa de 3 vías				Para el aparato de filtración
Filtros GV STERIVIX de 0,22 μm		EMD Millipore	SVGV01R5
Filtros GF/D de 47 mm de diámetro y 2,7 μm		Whatman, GE Healthcare	1823047
Tampón de lisis	Reactivo			0,75 M de sacarosa, 40 mM de EDTA, 50 mM de Tris (pH 8,3)
HCl al 0,1 %	Reactivo			Para enjuague posterior a la filtración
Agua autoclavada	Reactivo			Para enjuague posterior a la filtración