Este procedimiento muestra la purificación y la expansión in vitro de las células CD4 + antígeno específico de células T de sangre periférica y su visualización utilizando tetrámeros de MHC de clase II. Tetrámeros permitir la visualización directa de las células T con una especificidad de antígeno único y definido restricción MHC de clase II.
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Artículo de método
Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros
En este artículo
Resumen
Resumen
Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II tetrámeros permite la visualización directa de las células CD4 + antígeno específico de células T por citometría de flujo. Este método se basa en la interacción altamente específica entre el péptido cargado MHC y el receptor de células T correspondientes. Mientras que la afinidad de un único MHC / péptido molécula es baja, el entrecruzamiento complejos MHC / péptido con estreptavidina aumenta la avidez de la interacción, lo que permite su uso como reactivos de coloración. Debido a las frecuencias relativamente bajo de células CD4 + T (~ 1 en 300.000 para una sola especificidad), este ensayo utiliza un paso de amplificación in vitro para aumentar su umbral de detección. Las células mononucleares se purifican a partir de sangre periférica por subyace Ficoll. Las células CD4 + se separan por selección negativa con un cóctel de anticuerpos con biotina y anti-biotina marcada partículas magnéticas. El uso de células adherentes de la fracción de células CD4 en las células presentadoras de antígeno, células T CD4 + se amplió en los medios de comunicación mediante la adición de un péptido antigénico e IL-2. Las células se expanden son manchadas con la correspondiente clase II tetrámero mediante la incubación a 37 ° C durante una hora y posteriormente teñidos con anticuerpos de superficie, tales como anti-CD4, anti-CD3 y anti-CD25. Después de etiquetado, las células pueden ser directamente analizadas por citometría de flujo. Las células tetrámero positivo generalmente se forman una población distinta entre los CD4 + células ampliado. Tetrámero células positivas suelen ser CD25 + y CD4 alta frecuencia. Debido a que el nivel de tinción de fondo tetrámero puede variar, los resultados positivos de tinción debe estar siempre en comparación con la tinción de las mismas células con un tetrámero irrelevante. Múltiples variaciones de este ensayo básicos son posibles. Tetrámero células positivas pueden ser clasificados para su posterior análisis fenotípico, la inclusión en ELISPOT o los ensayos de proliferación, u otras pruebas secundarias. Varios grupos han demostrado también co-tinción con tetrámeros y, o bien anti-citoquinas y anticuerpos anti-FoxP3.
Protocolo
1. Sangre periférica de células mononucleares (PBMC) de aislamiento
- Obtener una muestra de sangre - la sangre deben ser recogidas en jeringas o tubos de sangre y anticoagulada con heparina (1:50 ratio) para prevenir la coagulación. Esperar un rendimiento de alrededor de 1 × 10 6 PBMC por ml de sangre - aproximadamente el 40% de los cuales se CD4 positivos (CD4 +) las células T.
- Alícuota de la sangre en tubos de 50 ml cónico de 25 ml por tubo. Si la sangre se ha separado, mezcle suavemente antes de alícuotas para la distribución del plasma
- Añadir PBS, con lo que el volumen total de 40 ml y subyace en la elaboración de 11 ml de....
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Discusión
Comprender el papel de las células CD4 + T en la inmunidad es de fundamental importancia. Sin embargo, CD4 + antígeno específico de células T puede ser difícil de detectar y aislar de manera artesanal. Por el contrario, tetrámeros de MHC de clase II permite la visualización directa de las células CD4 + T con el antígeno específico deseado. Este vídeo demuestra el aislamiento, purificación y amplificación in vitro de células T CD4 + y su posterior visualización utilizando tetrámeros. Tetrámeros Clase II son proteínas flu.......
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Agradecimientos
Agradecemos a Dick Foley y Kimball Leigh por su papel clave en la filmación y producción de vídeo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Campana de flujo laminar de Clase 2 | equipo | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | O equivalente |
| Tubo cónico de 50 mL | equipo | VWR international | 47747-182 | O equivalente |
| PBS 1X (sin Ca/Mg) | reactivo | Hyclone | SH30028.02 | O equivalente |
| Ficoll-paque PLUS | reactivo | GE Healthcare | 17-1440-03 | envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz |
| Pipet Aid XP | equipo | Drummond Scientific | 4-000-101 | O equivalente |
| Pipeta de 10 mL | equipo | Corning | CLS4492 | O equivalente |
| Cartuchos Aerosolve | equipo | Beckman Coulter Inc. | 359481 | con insertos de 50 mL |
| Centrífuga | equipo | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | O equivalente |
| Pipetas de transferencia | equipo | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | O equivalente |
| Pipetas Pasteur | equipo | VWR international | 14672-200 | O equivalente |
| Tampón hemolítico | reactivo | N/A | N/A | 8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L EDTA disódico |
| Azul de tripano | reactivo | Sigma-Aldrich | T6146 | 0,2% en PBS |
| Hemocitómetro | equipo | VWR international | 15170-208 | |
| Tubo cónico de 15 mL | equipo | VWR international | 05-527-90 | O equivalente |
| Tampón de trabajo | reactivo | N/A | N/A | PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA |
| Kit de aislamiento de células T CD4+ MACS II | reactivo | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | O equivalente |
| Imán EasySep® | equipo | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Tubo de polipropileno de 5 mL | equipo | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | reactivo | Invitrogen | 22400-089 | con 25 mM HEPES |
| Suero humano en pool | reactivo | N/A | N/A | obtenido de donantes sanos, inactivado por calor y filtrado |
| Pen Estrep | reactivo | Invitrogen | 1570-063 | O equivalente |
| Filtro de botella de 500 mL con poro de 0,22 micrones | equipo | Nalge Nunc international | 595-3320 | O equivalente |
| Placa de 48 pocillos | equipo | Costar | 3548 | O equivalente |
| Incubadora a 37°C con CO2 | equipo | Sanyo | MCO-18AIC | O equivalente |
| Péptido sintético de 20 mg/mL | reactivo | N/A | N/A | Síntesis personalizada de cualquier proveedor de péptidos |
| Tubo FACS de 5 mL | equipo | Falcon BD | 352008 | de poliestireno |
| Tetramero de clase II cargado con péptido (como se describe) | reactivo | N/A | N/A | Preparado por el núcleo de tetrameros del BRI |
| Anti-CD3 | reactivo | BD Biosciences | 347344 | O equivalente |
| Anti-CD4 | reactivo | eBioscience | 17-0049-73 | O equivalente |
| Anti-CD25 | reactivo | eBioscience | 11-0259-73 | O equivalente |
| Citómetro de flujo Facs Calibur | equipo | BD Biosciences | 342975 | O equivalente |
Referencias
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W.
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Reimpresiones y permisos
