Se describe un protocolo simple de identificar a las proteínas del cerebro que se unen a la terminal C de longitud completa de la ATP-dependientes P2X2 receptores. La extensión y aplicación sistemática de este enfoque a todos los receptores P2X se espera que conduzca a una mejor comprensión de la señalización del receptor P2X.
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Artículo de método
Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando
En este artículo
Resumen
Resumen
Ligando la base de los canales iónicos de comunicación sináptica en el sistema nervioso 1. En los mamíferos hay tres familias de ligandos de canales: el lazo cys, el glutamato y los canales de los receptores P2X 2. En cada caso, la unión de emisor lleva a la apertura de un poro por donde fluyen los iones de sus gradientes electroquímicos. Muchos ligando los canales también son permeables a los iones de calcio 3, 4, que tienen funciones de señalización hacia abajo 5 (por ejemplo, la regulación de genes) que pueden superar la duración de la apertura del canal. Así, ligando los canales pueden ser señal en escalas de tiempo amplio que van desde unos pocos milisegundos a días. Teniendo en cuenta estas importantes funciones, es necesario entender cómo ligando los canales iónicos se están reguladas por las proteínas, y cómo estas proteínas pueden sintonizar señales. Estudios recientes sugieren que muchos, si no todos, los canales pueden ser parte de complejos de proteínas de señalización 6. En este artículo se explica cómo identificar las proteínas que se unen a los aspectos C-terminal del dominio del receptor P2X2 citosólica.
Receptores P2X ATP-dependientes canales de cationes y constará de siete subunidades (P2X1-P2X7). Receptores P2X se expresan ampliamente en el cerebro, donde median la transmisión sináptica excitatoria y la facilitación presináptica de la liberación de neurotransmisores 7. Receptores P2X se encuentran en las células excitables y no excitables y mediar un papel clave en la señalización neuronal, la inflamación y la función cardiovascular 8. P2X2 receptores son abundantes en el sistema nervioso 9 y son el foco de este estudio. Cada subunidad P2X se cree que tiene dos segmentos que atraviesan la membrana (TM1 y TM2), separadas por una región extracelular intracelular 7 y N y C terminales (Fig. 1a) 7. Subunidades P2X 10 (P2X1-P2X7) muestran un 30-50% de homología de secuencia en el nivel de aminoácidos 11. Receptores P2X contienen sólo tres subunidades, que es el más simple estequiometría entre los receptores ionotrópicos. El P2X2 C-terminal consta de 120 aminoácidos (Figura 1b) y contiene varias proteínas consenso sitios de atraque, que apoya la hipótesis de que P2X2 receptor puede ser parte de complejos de señalización. Sin embargo, a pesar de varias funciones han sido atribuidas a la C-terminal de los receptores P2X2 nueve ningún estudio ha descrito los socios molecular que se acoplan a la parte intracelular de esta proteína a través de toda la longitud C-terminal. En este artículo se describen los métodos de una aproximación proteómica para identificar las proteínas que interactúan con el cuerpo entero C-terminal de los receptores P2X2.
Protocolo
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El procedimiento experimental (Fig. 2) consta de cuatro partes que se describen de una manera gradual a continuación.
Parte 1: Subclonación y la expresión de la C-terminal de los receptores P2X2.
Hemos expresado la longitud C-terminal de los receptores P2X2 en las bacterias para identificar las proteínas del cerebro al que se une.
- El C-terminal (residuos 353-472) de los receptores P2X2 (Fig. 1) fue amplificado por PCR, clonado en pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) y se verificó con la secuenciación.
- El plásmido recombinante se transformó en <....
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Discusión
Los canales iónicos son una clase importante de proteínas integrales de membrana. Que contienen poros llenos de agua que permiten selectivamente el movimiento de iones por sus gradientes electroquímicos a través de la membrana plasmática. Los canales iónicos puerta entre abierta y cerrada de los estados. El paso de disparo es activado por los transmisores (por ejemplo, ATP) en el caso de los canales iónicos P2X ligando, o puede ser regulada por las interacciones con otras proteínas. La última década ha sido testigo de u.......
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Agradecimientos
SW y TMV son apoyados por la CNRR y el NHLBI en los Institutos Nacionales de Salud. BSK SA y son apoyados por el NINDS y NIGMS de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Acrilonitrilo | Reactivo | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrilamida | Reactivo | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicilina | Reactivo | VWR international | VW1507-01 | |
| Bicarbonato amónico | Reactivo | Fluka | 09830 | |
| Persulfato amónico (APS) | Reactivo | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosín trifosfato (ATP) | Reactivo | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Reactivo de Bradford | Reactivo | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Azul de bromofenol | Reactivo | Fisher Scientific | B-392 | |
| Comassie azul R-250 | Reactivo | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Reactivo | EMD Millipore | 3860 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Reactivo | VWR international | VW1474-01 | |
| Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) | Reactivo | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Ácido fórmico | Reactivo | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Perlas de Sepharosa de glutatión 4B | Reactivo | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Ácido clorhídrico (HCl) | Reactivo | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG) | Reactivo | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamida | Reactivo | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Medio Luria-Bertani (LB) | Reactivo | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptina | Reactivo | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lisozima | Reactivo | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Reactivo | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Reactivo | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fluoruro de sodio (NaF) | Reactivo | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Ortovanadato de sodio (Na3VO4) | Reactivo | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reactivo | Fluka | 74385 | |
| Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF) | Reactivo | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Tableta inhibidora de proteasas | Reactivo | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Estandar de proteína | Reactivo | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reactivo | Acros Organics | 61207 | |
| Vial con tapón roscado | Herramienta | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Dodecilsulfato de sodio | Reactivo | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tinte para geles de proteínas SYPRO® Ruby | Reactivo | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Reactivo | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Base de Tris | Reactivo | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tritón X-100 | Reactivo | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tripsina | Reactivo | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reactivo | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Agua | Reactivo | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| Espectrómetro de masas en tándem LTQ-Orbitrap | Herramienta | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sistema de cromatografía líquida en nanoescala | Herramienta | Eksigent | ||
| 2-Mercapto–etanol | Reactivo | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glicerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
Referencias
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
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Reimpresiones y permisos
