Derivación de los precursores neuroepiteliales de células madre embrionarias (ES) las células utilizando células estromales derivadas de la actividad de inducción (SDIA).
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Artículo de método
ES células derivadas de células de las Culturas neuroepiteliales
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Resumen
Resumen
Células madre embrionarias tienen el potencial de diferenciarse en células de todas las capas germinales, que los convierte en una herramienta atractiva para el desarrollo de nuevas terapias. En general, la diferenciación de las células madre embrionarias sigue el concepto de generar primero las células progenitoras inmaduras, lo que puede ser propagado y diferenciarse en fenotipos celulares maduros. Esto también se aplica ES células derivadas de la neurogénesis, en el que el desarrollo de las células nerviosas después de dos pasos principales: en primer lugar, la derivación y la expansión de inmaduros precursores neuroepiteliales y la segunda, su diferenciación en células maduras neural. Un método común para producir progenitores neurales de células madre embrionarias se basa en el cuerpo embrioides (EB) la formación, lo que revela la diferenciación de las células de todas las capas germinales incluyendo neuroectodermo. Un método alternativo y más eficiente para inducir el desarrollo de células neuroepiteliales utiliza células estromales derivadas de la actividad de la inducción (SDIA), que se puede lograr mediante el cultivo de células madre embrionarias cooperación con los huesos del cráneo derivadas de la médula las células del estroma (1). Tanto, la formación de EB y SDIA, revelan el desarrollo de la roseta-como las estructuras, que se cree que se asemejan en el tubo neural y / o progenitores neurales como la cresta. Los precursores neuronales pueden ser aislados, ampliado y diferenciado aún más hasta convertirse en neuronas específicas y las células gliales con las condiciones definidas por la cultura. Aquí se describe la generación y el aislamiento de rosetas como en los experimentos de co-cultivo con la línea de células del estroma MS5 (2-5).
Protocolo
Paso 1
- Placa de mitomicina-C ggrowth inhibido (10 mg / ml durante 2,5 horas) MS5 las células a una densidad de 70.000 / cm2 en recubiertos de gelatina (0,01% durante 30 minutos) 6 placas en α-MEM medios de comunicación.
- Cuando las células se unen y se han formado una monocapa (sobre el crecimiento de la noche), cambiar a SRM.
- Manualmente aislar colonias de células ES de los cultivos de células ES mediante una jeringa con una aguja de 27 G ½.
- Tritrurate las colonias con cuidado con una punta de 1 ml y una placa azul en baja densidad en el MS5 células (normalmente 2-3 colonias por placa y 6).
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Discusión
Este protocolo demuestra los diferentes pasos en la creación y aislamiento de células neuroepiteliales de células madre embrionarias humanas con SDIA. La aplicación de este método es múltiple y se ha utilizado en muchos protocolos para producir neuronas específicas (por ejemplo 1, 2, 5-9). Las rosetas se cree que se asemejan a las células del tubo neural con un fenotipo anterior (2, 5, 10) y también contienen células progenitoras de la cresta neural (11, 12). Además, conservan un cierto nivel de plasticidad, ya que pueden ser modelados por .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| L-glutamina | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| α-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicilina/estreptomicina | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Sustituto de suero Knockout | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| Solución de aminoácidos no esenciales MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| Suplemento N2-A | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomicina-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatina tipo A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poli-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | solución al 0,01% | |
| Laminina | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| Jeringa de 1 mL con aguja de 27 1/2 G | BD Biosciences | 309623 | ||
| Medio N2-A | medio | DMEM/F12 + 1% de suplemento N2-A | ||
| Medio con sustituto de suero (SRM) | medio | Knockout-DMEM + 20% de sustituto de suero Knockout + 1% de solución de aminoácidos no esenciales MEM + 2 mM de L-glutamina | ||
| α-MEM medio | medio | α-MEM + 10% de SFB + 2 mM de L-glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina | ||
| MS5 | línea celular | células estromales | ||
| Microscopio | ||||
| Placas de 6 pocillos | para cultivo de tejidos |
Referencias
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Perrier, A. L., et al. Derivation....
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