Artículo de método

ES células derivadas de células de las Culturas neuroepiteliales

DOI:

10.3791/118

⸱

30 de noviembre de 2006

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

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Derivación de los precursores neuroepiteliales de células madre embrionarias (ES) las células utilizando células estromales derivadas de la actividad de inducción (SDIA).

Resumen

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Células madre embrionarias tienen el potencial de diferenciarse en células de todas las capas germinales, que los convierte en una herramienta atractiva para el desarrollo de nuevas terapias. En general, la diferenciación de las células madre embrionarias sigue el concepto de generar primero las células progenitoras inmaduras, lo que puede ser propagado y diferenciarse en fenotipos celulares maduros. Esto también se aplica ES células derivadas de la neurogénesis, en el que el desarrollo de las células nerviosas después de dos pasos principales: en primer lugar, la derivación y la expansión de inmaduros precursores neuroepiteliales y la segunda, su diferenciación en células maduras neural. Un método común para producir progenitores neurales de células madre embrionarias se basa en el cuerpo embrioides (EB) la formación, lo que revela la diferenciación de las células de todas las capas germinales incluyendo neuroectodermo. Un método alternativo y más eficiente para inducir el desarrollo de células neuroepiteliales utiliza células estromales derivadas de la actividad de la inducción (SDIA), que se puede lograr mediante el cultivo de células madre embrionarias cooperación con los huesos del cráneo derivadas de la médula las células del estroma (1). Tanto, la formación de EB y SDIA, revelan el desarrollo de la roseta-como las estructuras, que se cree que se asemejan en el tubo neural y / o progenitores neurales como la cresta. Los precursores neuronales pueden ser aislados, ampliado y diferenciado aún más hasta convertirse en neuronas específicas y las células gliales con las condiciones definidas por la cultura. Aquí se describe la generación y el aislamiento de rosetas como en los experimentos de co-cultivo con la línea de células del estroma MS5 (2-5).

Protocolo

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Paso 1

  1. Placa de mitomicina-C ggrowth inhibido (10 mg / ml durante 2,5 horas) MS5 las células a una densidad de 70.000 / cm2 en recubiertos de gelatina (0,01% durante 30 minutos) 6 placas en α-MEM medios de comunicación.
  2. Cuando las células se unen y se han formado una monocapa (sobre el crecimiento de la noche), cambiar a SRM.
  3. Manualmente aislar colonias de células ES de los cultivos de células ES mediante una jeringa con una aguja de 27 G ½.
  4. Tritrurate las colonias con cuidado con una punta de 1 ml y una placa azul en baja densidad en el MS5 células (normalmente 2-3 colonias por placa y 6).

Nota: Las células madre embrionarias también se puede tomar de la propagación enzimática con colagenasa y tripsina.

Paso 2

  1. Crecen las células madre embrionarias en el MS5 alimentadores durante 14-21 días hasta roseta que contienen la formación de colonias.


Nota: los medios de comunicación cambian a menudo. Las rosetas son por lo general en los bordes exteriores de las colonias y su formación puede ser mucho mayor si 300-500 ng / ml Noggin se añade a la SRM (3). En algunos protocolos de diferenciación, SRM se pueden intercambiar con N2-A los medios de comunicación y se complementa con el crecimiento y otros factores para promover la especificación de células (2-5).

Paso 3

  1. Aislar y recoger las rosetas con una aguja de 27 ½ G con un microscopio.

Nota: Evite cortar y recoger el MS5 las células del estroma. Si las colonias están llenos de rosetas, también se puede aislar a toda la colonia.


Paso 4

  1. Aspirar los grupos de rosetas, los tritrurate cuidadosamente con la punta de 1 ml azul, y la placa que en la poli-L-ornitina (0,001%) y fibronectina (1 mg / ml) o laminina (1 mg / ml) con cubierta de 6 pozos N2-A los medios de comunicación suelen complementarse con bFGF (20 ng / ml). Las rosetas se reforma y expansión.

Nota: Para mejorar la supervivencia de las células, se puede placa pequeños grupos en las gotas para aumentar la densidad celular. Este paso también puede ser modificada por que complementa la N2-A los medios de comunicación, con un crecimiento adicional u otros factores para promover la especificación de células (2-5).

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Discusión

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Este protocolo demuestra los diferentes pasos en la creación y aislamiento de células neuroepiteliales de células madre embrionarias humanas con SDIA. La aplicación de este método es múltiple y se ha utilizado en muchos protocolos para producir neuronas específicas (por ejemplo 1, 2, 5-9). Las rosetas se cree que se asemejan a las células del tubo neural con un fenotipo anterior (2, 5, 10) y también contienen células progenitoras de la cresta neural (11, 12). Además, conservan un cierto nivel de plasticidad, ya que pueden ser modelados por ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
L-glutaminaGIBCO, by Life Technologies25030
α-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
Penicilina/estreptomicinaGIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Sustituto de suero KnockoutGIBCO, by Life Technologies10828
Solución de aminoácidos no esenciales MEMGIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
Suplemento N2-AStem Cell Technologies07152
Mitomicina-CSigma-AldrichM0503
Gelatina tipo ASigma-AldrichG1890
poli-L-ornitinaSigma-AldrichP4957solución al 0,01%
LamininaSigma-AldrichL-2020
FibronectinaSigma-AldrichF2006
Factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)Invitrogen13256
Jeringa de 1 mL con aguja de 27 1/2 GBD Biosciences309623
Medio N2-AmedioDMEM/F12 + 1% de suplemento N2-A
Medio con sustituto de suero (SRM)medioKnockout-DMEM + 20% de sustituto de suero Knockout + 1% de solución de aminoácidos no esenciales MEM + 2 mM de L-glutamina
α-MEM mediomedioα-MEM + 10% de SFB + 2 mM de L-glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina
MS5línea celularcélulas estromales
Microscopio
Placas de 6 pocillospara cultivo de tejidos

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
  12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).

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