En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.
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Artículo de método
Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal
En este artículo
Resumen
Resumen
En este vídeo, se demuestra el método de nuestro laboratorio ha desarrollado para analizar los cambios en la forma celular y los reordenamientos requeridos para doblar y doblar el cerebro del pez cebra en desarrollo (Gutzman et al, 2008). Este tipo de análisis permite una nueva comprensión de la biología de las células subyacentes necesarios para el desarrollo de la estructura 3D del cerebro de los vertebrados, y aumenta de forma significativa nuestra capacidad de estudiar la morfogénesis del tubo neural. El cerebro tiene la forma de pez cebra embrionarias a partir de las 18 horas posteriores a la fecundación (HPF) en los ventrículos en el neuroepitelio inflar. Un 24 por HPF, los pasos iniciales de la morfogénesis del tubo neural se completa. Utilizando el método descrito aquí, los embriones en la etapa de una célula son inyectados con mRNA de membrana específicos de proteína verde fluorescente (memGFP). Después de la inyección y ahora de incubación, el embrión, entre 18 y 24 HPF, se monta, en posición invertida, en gel de agarosa y la imagen por microscopía confocal. En particular, el embrión de pez cebra es transparente por lo que es un sistema ideal para la proyección de imagen fluorescente. Si bien nuestro análisis se han centrado en el límite del cerebro medio-hindbrain y la parte posterior del cerebro, este método puede ser extendido para el análisis de cualquier región en el pez cebra a una profundidad de 80 a 100 micras.
Protocolo
1. Preparación de los ARNm para inyección
- El ARNm utilizados en este procedimiento se transcribe a partir de un plásmido que codifica CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. En primer lugar linealizar el plásmido de acuerdo con Gutzman et al, 2008.
- A continuación transcribimos ARNm memGFP con el mMessage mMachine kit.
- Diluir el ARNm resultante de 1μg/μl, alícuota y almacenar a -80 ° C.
- Preparar un molde de inyección de agarosa al 1% con los carriles de la anchura de los embriones en la etapa de la célula.
- El día antes de la inyección, creado jaulas de apareamiento que separa el macho de las hembras.
- En el día de la inyecc....
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Discusión
En este vídeo, se demuestra un método para la inyección de ARNm en una sola célula de embriones de pez cebra. En este sentido, el uso de ARNm que codifica una membrana GFP dirigida a la etiqueta de cada célula. A continuación se muestra cómo montar y la imagen del cerebro en desarrollo con una resolución única célula. Esta técnica nos ha permitido estudiar un nuevo tipo de cambio en las células forma, constricción basal, necesario para la formación de la frontera del cerebro medio-hindbrain (Gutzman et al, 2008). Un aná.......
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Agradecimientos
Muchas gracias a la Dra. Jennifer Gutzman que desarrolló por primera vez esta técnica en el laboratorio SIVE. Gracias también a JB Verde en el Dana-Farber Cancer Institute de Boston, MA, quien amablemente proporcionó el plásmido que codifica CAAX-GFP ARNm. La imagen confocal se llevó a cabo en las instalaciones de la Fundación WM Keck de imágenes biológicas en el Whitehead. SA, con el apoyo de NIHMH70926. EG es apoyada por un NSF beca pre-doctoral.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Agarosa SeaKem GTG | Reactivo | Lonza Inc. | 50027 | |
| Éster etílico del ácido 3-aminobenzoico (Tricaina) | Reactivo | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Tubos capilares | Herramienta | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/fibra 100 mm |
| Grasa de vacío de silicona | Reactivo | VWR international | W0S717 | |
| Pinzas | Herramienta | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont n.º 5 Bio Inox |
| Puntas de pipeta de 1-200 μl | Herramienta | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | Estos son del tamaño correcto para embriones de 24 hpf. |
| Kit de transcripción mMessage mMachine | Reactivo | Ambion | AM1340 | Polimerasa SP6 ARN |
| Microscopio confocal de barrido Zeiss LSM 510 | Microscopio | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micromanipulador | Herramienta | Narishige International | ||
| Microinyector | Herramienta | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Extractor de micropipetas | Herramienta | Sutter Instrument Co. |
Referencias
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laborat....
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Reimpresiones y permisos
