Summary
Vi beskriver en ny kirurgisk metod för catheterizing "tarmen loopar" i ileum från får. När djuren har återhämtat sig från operationen och har rensat antibiotika och analgetika kan flera behandlingar att deponeras direkt i slingor via katetrar.
Abstract
Tarmen är en komplex struktur som är inblandad inte bara i absorption av näringsämnen, men också fungerar som en barriär mellan individen och omvärlden. Som sådan, spelar tarmen en central roll i immunosurveillance och skydd från tarmpatogener. Undersöka tarm fysiologi och immunologi ofta använder "tarm loopar" som en experimentell modell. Majoriteten av dessa slinga modeller är inte återvinns kirurgiska ingrepp som studerar på kort sikt (<24 h) förändringar i tarmen (1-3). Vi skapade tidigare en återhämtning tarm slinga modell för att specifikt mäta på lång sikt (<6 mån) immunologiska förändringar i tarmen av får efter exponering av vacciner, adjuvans, och virus (4). Detta förfarande lokaliserad behandlingar till en speciell "slinga", tillåter oss att prova denna del av tarmen. En stor nackdel med denna metod är den enda gyllene tillfälle att administrera behandlingar (dvs vid tidpunkten för kirurgi). Dessutom kan prover på både tarmslemhinnan och luminala innehållet endast tas vid slutet av projektet. Andra framträdande begränsningar av ovanstående modell är att den kirurgiska manipulationen och erforderliga postoperativa åtgärder (t.ex. administrering av antibiotika och analgetika) direkt kan påverka själva vården och / eller ändra immunförsvar, vilket förbryllande resultat. Därför ändrade vi våra intestinal slinga modell genom att sätta långsiktiga katetrar i slingor. Får återhämta sig helt från förfarandet, och inte påverkas av exteriorized katetrar. Framför allt tillåter etablering av katetrar i slingor oss att presentera flera behandlingar under en längre intervall, efter återhämtning från kirurgi och clearance av läkemedel som ges under operationen och den postoperativa perioden.
Protocol
Tillvägagångssätt:
- Alla instrument är autoklaveras, icke-autoclaveable material steriliseras i Germex kall sterilisering lösningen i minst 10 min.
- Får är premedicineras med acepromazin (0,05 mg / kg), glykopyrrolat (0,005 mg / kg) och butorfanoltartrat (0,2 mg / kg) IM, och vänster i 15-20 min.
- Halsen är rakat och huden kirurgiskt skiljdes ut. När halspulsåder visualiseras, är 0,1 ml lidokain injiceras SC över venen är katetern förs in i venen och fast på huden med hjälp av boskap cement identifiering tagg och 2 "sjukhus tejp. Under operation, är de djur som fått 10 ml / kg / timme av Plasmalyte 148 (med självfall).
- Diazepam (0,2 mg / kg) administreras IV och anestesi induceras med tiopentalnatrium (10 mg / kg). Lidokain endotrakeal spray är appliceras på stämbanden är fåren intuberas, och underhållas på isofluran (1,5-2,5% i 100% O 2 med en hastighet av 4 liter / min) under hela operationen.
- Djuret är placerad i rygg VILA på en uppvärmd matta för att upprätthålla kroppstemperaturen under operation. En magsond sätts in i våmmen för att förhindra alltför tympany.
- Den ventrala buken är rakat och huden är förberedd för operation med tre Prepodyne kirurgiska buskmarker. Buken är då draperad, se till att lämpliga exponering av operationsområdet (naveln till stjärtfenan buken) bibehålls.
- En 15-20 cm mittlinje snitt görs med hjälp av en electroscapel, caudally från naveln och ileocecal luckan är placerad i nedre högra kvadranten av buken. Den caudal ileum och blindtarmen då exteriorized. Under hela förfarandet, är hanteringen av tarmen minimeras och omsorg för att garantera exteriorized tarmen hålls fuktig med varmt (37-39 ° C) steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,2).
- En 85 cm segment av ileum (dvs "intestinala segmentet") mäts och sedan spännas med Doyen pincett (intestinala klämmor) och stora Kelly pincett i varje ände av segmentet. Inom intestinala segmentet kommer att "loopar" och "hålrum" mellan slingorna fastställas. Nestorn pincett är placerade på sidan av ileum som ska sammanfogas (anastomos) och Kelly pincett är placerade på intestinala segmentet sidan av ileum.
- Ileum klipps mellan varje Doyen och Kelly forcep och intestinala segmentet utses för slingorna är försiktigt spolas två gånger med 60 ml varmt PBS för att avlägsna maginnehållet.
- En cocktail av bredspektrumantibiotika (200 mg enrofloxacin och 250 mg metronidazol i varma PBS, 60 ml totala volymen) är fördelade över hela tarmen segmentet och vänster i 30 min.
- Den proximala och distala skär ändarna av ileum (exklusive intestinala segmentet) förenas för att bilda en sammanhängande och funktionell tarmkanalen. För det första är ileum justeras av två stannar suturer, placerad vid mesenteriska och antimesenteric gränser i tarmen, respektive. Då är en enkel kontinuerlig sutur mönster (2-0 Vicryl) slutfördes på båda sidor av tarmen att ansluta sig till tarmen tillsammans.
- Varm PBS (3-5 ml) injiceras vid anastomos platsen för att kontrollera om läckage och sutur misslyckande. Sedan är toppen av Kelly forcep pressas mot den serös ytan av tarmen, nära platsen för den anastomos webbplatsen, och avancerade inåt vid anastomos platsen för att säkerställa den intestinala lumen är stor och patent.
- Den antibiotika cocktail tas bort från intestinala segmentet. Varje ände av segmentet stängs med en enkel kontinuerlig sutur mönster (absorberbara suturer, 2-0 Vicryl) följt av en vända sutur mönster med 2-0 Vicryl.
- Den 85 cm långa intestinala segmentet är uppdelad i tre 15 cm "loopar", två 15 cm långa "hålrum" mellan loopar och två 5 cm långa trubbiga slut fack vid ändstationer den intestinala segmentet (Figur 1) . Slingorna skapas genom att placera en ligatur runt tarmen med hjälp av 2-0 silke. Det är anmärkningsvärt att stora mesenteriska fartyg inte knyts ihop under detta förfarande, eftersom dessa behövs för att förse tarmen med blod, upprätthålla intestinal livskraft. Dessutom är de ligaturer kvar länge, eftersom de kommer att användas för att säkra katetrar.
- Katetrar (dvs silastic slangar) är individuellt identifierade med hjälp av en permanent märkpenna. En kisel boll (5 mm diameter) går runt katetern placeras 4-5 cm från katetern slutet för att förhindra katetern från att glida ut i tarmen (Figur 1). Efter sterilisering i autoklav, är en icke-antibiotisk salva (Orbeseal) aseptiskt in i katetern slutet (3-5 mm), vilket säkerställer att katetern är patent (dvs. den inte blir inkopplad genom sloughed slemhinna i slinga).
- Ett litet snitt läggs på kraniella aspekt av varje av de tre slingor. Varje hål är förstorad med en kateter introduktör (dvs "fartyg dilator") och en 6-8 cm segment av kateter sätts caudally islingan, tills silcone bollen passerar in i lumen (Figur 1).
- Tarmväggen är säkrad runt katetern med en handväska sträng sutur (2-0 Vicryl). Katetern är vidare fast i tarmen genom att binda katetern med ligatur siden som avgränsas den kraniala slutet av slingan.
- Ampicillin (5 ml, 100 mg / ml i varma PBS) injiceras i varje båge och mellanrum, och tarmen läggs tillbaka i bukhålan. Cefazolin (8 ml, 100 mg / ml i varma PBS) sprutas in i bukhålan genom buksnitt.
- En enda liten sticka snitt görs genom bukväggen intill mittlinjen snitt, och katetrar är exteriorized via denna webbplats.
- Läge och spänning av katetrar justeras i bukhålan. Bukmusklerna är förslutna med en avbruten enkel sutur mönster (absorberbara suturer, katgut # 3), och huden är stängd med en avbruten horisontella madrass mönster (icke absorberbara suturer, Supramid # 1).
- En böjd ihåligt rostfritt stål (7 mm innerdiameter, 10 mm ytterdiameter, 65 cm lång) förs in under huden nära buksnitt, tunnel under huden till en avfart webbplats bara caudal till halsen och mellan skulderbladen. Den katetrar förs in i röret och skjutas framåt för minst 50% av rörets längd. Röret med katetrar är då dras från huden vid utfarten platsen, exponera katetrar.
- Spänningen av katetrar justeras vid knivhugg snitt webbplatsen och huden är stängd med Supramid # 1.
- Individuella katetrar identifieras och placeras inom ett bandage "påse" som sys fast på huden med Supramid # 1. Påsen skyddar katetrar från efterföljande skador.
- Postoperativt, är får injiceras IM med Flunixin (Sid) en startdos 2,2 mg / kg, följt av en underhållsdos på 1,1 mg / kg SID för 3 dagar. Får också injiceras IM med Hemostam (3 ml) och enrofloxacin (2,5 mg / kg) SID för 3 och 5 dagar, respektive. Djuren hålls på intravenös Plasmalyte 148 med 5% glukoslösning, administreras kontinuerligt med peristaltiska pumpar för att säkerställa att flödet (145 ml / timme) fortsätter oavsett kroppsställning. De får dricka efter behag, men foder är begränsad tills normal vommen och funktioner tarm återställs. Födointag, vattenförbrukning, kroppstemperatur, passage av avföring och urin, ljud gut, magbesvär, uppförande och blodglukos övervakas noga (bud), när det behövs, är glukosvärdet hos de intravenösa vätskor justeras till att hålla blodsockernivån inom det normala intervallet. Blod kemi och hematologi (t.ex. albumin, alkaliskt fosfatas, alaninaminotransferas, amylas, kalcium, kolesterol, kreatinin, glukos, oorganiskt fosfat, totalt bilirubin, totalt protein, urea, globulin, natrium, kalium, klorid, partialtrycket syrgas, pH, partiell tryck koldioxid, bikarbonat, och total koldioxid, röda och vita blodkroppar, hematokrit, hemoglobin, differentialräkning av vita blodkroppar och blodplättar) kontrolleras före och omedelbart efter operationen, och varannan dag därefter. När normal tarmfunktion påbörjas, intravenös vätskebehandling är avslutad och djur överförs till hagar (det vill säga 5-7 dagar efter operation). Djuren hålls i individuella boxar (inom synhåll för andra djur), vilket minskar stress och risken för skadelidande till sin kateter påsar (t.ex. tugga av en penmate).
- Att injicera behandlingar i enskilda slingor, är 5 ml av den behandling sprutas in i katetern med en steril spruta med en 18 gauge, trubbig slutade nål. För att säkerställa att nedfallet av alla behandling i slingan är katetern sedan injiceras med 3 ml PBS.
Kritiska punkter:
Förfaranden av avgörande betydelse för framgången för detta kirurgiska ingrepp är: (1) kontrollera att tarmen inte är vriden på sig själv innan det anastomos, (2) säkerställande av integriteten och öppetståendet av anastomos, (3) tillräckligt säkra katetern slingan väggen med ligatur avgränsar kraniala slutet av slingan, men se till att den bifogade filen inte påverkar öppetståendet av katetern, (4) minimera tarmen hantering och att se till att exteriorized tarmen hålls fuktig, (5) säkerställa att tillräckliga katetern spänning, (6) säkerställa att integriteten i katetern inte påverkas under muskler och hud suturering, (7) förhindra smaska av får efter operationen (dvs under tiden av postoperativ ileus) som kan orsaka ruminal impaktion och nedskrivningar av våmmen funktion, och (8) se till att djuren får tillräckligt med intravenös vätsketerapi under de första 3-5 dagarna efter operationen, är att blodglukoskoncentrationen övervakas noggrant, och glukosvärdet hos den intravenösa vätskor är adjusTed om det är nödvändigt för att förhindra hypoglykemi. 
Figur 1. En schematisk bild av kateter ileal slingor. Notera de tre 15 cm långa kateter "loopar", de två 15 cm långa icke-kateter "hålrum" upprättas mellan loopar, och de två 5 cm långa segment terminal alla inom en 85 cm lång "intestinala segmentet "av ett får ileum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta förfarande kunde vi framgångsrikt etablera katetrar i tarmen loopar etablerad inom ileum från får. Genom att följa stränga postoperativ vård, återhämtat sig djur snabbt från förfarandet och återupptogs normal aktivitet 5-7 dagar efter operationen. Vi bestämde att inrättandet av katetrar inom loopar inte påverkar tarmslemhinnans eller immunförsvar (data visas inte) och djur kan leva i minst 8 vecka efter operationen. Detta förfarande ger oss möjlighet att introducera flera behandlingar i olika immunologiska fack under en längre intervall, när djur har återhämtat sig från operation, och för att empiriskt mäta fysiologiska och immunologiska effekter av dessa behandlingar.
En viktig fråga för framtida experiment är platsen för den intestinala segmentet inom tunntarmen. I detta förfarande har vi skapat kirurgiskt tarmens segmentet inom "immunologiskt funktionella ileum" som ofta definieras av ileal (kontinuerlig) Peyers plack (5,6). Detta område kan sträcka cranially upp till 2 m utanför ileocecal gånger. Även denna region anses anatomiskt som jejunum, i samband med immunologiska funktion, är det ileum, och de betonar vikten av att betrakta funktion när man beskriver intestinal regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla förfaranden på försöksdjur har godkänts av Institutional Animal Care kommittén (Animal använda protokoll # 0609) och följt de riktlinjer som fastställts av den kanadensiska rådet Animal Care.
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Forskningen skulle inte ha kunnat genomföras utan det engagemang och insatser av många personer vid jordbruks-och livsmedelssektorn Kanada Research Centre, Lethbridge, Alberta, Kanada. I det avseendet tackar vi: Tara Shelton för pre-och postoperativ vård av djur, kirurgisk förberedelse och anestesiologi, analys av prover, och hjälp med video bildhantering, Randy Wilde och Estela Costa för pre-och postoperativ vård; Jenny Gusse för provanalys, Byron Lee för troakar bilden, och Brian Egland för får djurhållning. Vi tackar också Brent Selinger (Department of Biological Sciences, University of Lethbridge) för att ge videoutrustning och råd, samt andra stöd (dvs verkställande produktion), och läroplanen Re-Development Centre, University of Lethbridge för Videografi expertis. Denna studie har delvis stöd i bidrag från avancerade Foods och Materials Network (GDI), mellan Kanada och Alberta Beef Industry Development Fund (GDI), jordbruk och livsmedelsindustri Kanada (GDI och JPK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103091 | |
| Surgical mask | Western Drug Distribution Center, Ltd. | MAX53013 | |
| Surgical gown | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 3365 | |
| OB Apron | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900062 | |
| Surgical cap | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903271 | |
| EZ Scrub brush | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC377479 | |
| Anesthetic machine | Boyle | - | |
| Sodasorb | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108638 | |
| Laryngoscope | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Laryngoscope blade (Miller blade #4) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 902667 | |
| Endotracheal tube (7.0 - 8.5 mm) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Lidocaine endotracheal spray | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103364 | |
| Acepromazine | Western Drug Distribution Center, Ltd. | AUS01020 | |
| Glycopyrrolate | Western Drug Distribution Center, Ltd. | SAB2880 | |
| Butorphanol tartrate | Western Drug Distribution Center, Ltd. | AYE304541 | |
| Diazepam | Western Drug Distribution Center, Ltd. | sab790 | |
| Thiopental sodium | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103508 | |
| Epinephrine hydrochloride | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103856 | |
| Doxapram | Strathcona Pharmacy | - | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 100339 | |
| Hemostam | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103857 | |
| Flunixin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | sch140100 | |
| Enrofloxacin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | hll0049 | |
| Metronidazole | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 101653 | |
| Ampicillin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | NOV67185-6 | |
| Cefazolin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | nov69397 | |
| Electroscapel | Macan | MV8 | |
| Heating mat | Kane | PHMD-48 | |
| Stomach tube (Nalgene tubing 5/16" ID) | Fisher Scientific | - | |
| Needle driver | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108338 | |
| Addison brown forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 911075 | |
| Rat tooth forcep | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 5275 | |
| Kelly forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901133 | |
| Mosquito hemostat | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108471 | |
| Carmalt forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901225 | |
| Scalpel handle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900285 | |
| Scalpel blade #22 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900511 | |
| Metzenbaum scissor | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901166 | |
| Sharp-sharp scissor | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108264 | |
| Towel clamp | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901213 | |
| Allis tissue forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901201 | |
| Doyen’s forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 904226 | |
| Stainless steel bowl | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903601 | |
| Stainless steel trocar (curved) | Local Supplier | - | |
| Catheter introducer | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 11440 | |
| Surgical towel | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 7972 | |
| Disposable drape | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900035 | |
| Steri drape | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 2323 | |
| Drape (40 x 40 cm) | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 8358 | |
| Surgical drape (7" x 11 ¼" opening) | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 2694 | |
| Vicryl (2-0) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | JJMJ333H | |
| Silk 2-0 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105248 | |
| Catgut #3 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | CSL547-2070 | |
| Supramid #1 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | CSL547-3040 | |
| Needles (cutting and non-cutting) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Silastic tubing (0.040" ID, 0.085" OD) | Fisher Scientific | 11-189-15D | |
| Orbeseal ointment | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 106344 | |
| Clear silicone (732 multi-purpose sealant) | Local Supplier | - | |
| Blunt end needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 905035 | |
| Marker (permanent industrial) | Local Supplier | - | |
| Catheter pouch (constructed of Elastoplast 7.5 cm) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104094 | |
| Hospital tape (2") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103842 | |
| Hospital tape (1") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | VLMRENF20 | |
| Gauze sponge 4x4 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 107551 | |
| Gauze cling | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 107633 | |
| Elastoplast 7.5cm | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104094 | |
| Elastoplast rippable bandage | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104093 | |
| Syringe (60 ml) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104004 | |
| Syringe (10 ml) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | bdc301604 | |
| 25G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC305122 | |
| 20G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC305175 | |
| 18G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903353 | |
| Intracath IV catheter (16G 8") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | bdc3831621 | |
| IV administration set (10 drop) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 101797 | |
| 0.9% NaCl solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BAXJB1322P | |
| Plasmalyte 148 solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BAXJB2534 | |
| Dextrose | Western Drug Distribution Center, Ltd. | MCT60190 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 7524-10 | |
| Livestock identification tag cement | Local Supplier | - | |
| Germex solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | mtc60270 | |
| Isopropyl alcohol | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104590 | |
| Stanhexidine cleanser | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 109248 | |
| Prepodyne solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105710 | |
| Prepodyne scrub | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105711 |
References
- Vidal, J. E., McClane, B. A., Saputo, J., Parker, J., Uzal, F. A. Effects of Clostridium perfringens beta-toxin on the rabbit small intestine and colon. Infect. Immun. 76, 4396-4404 (2008).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet. Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Uzzau, S., Leori, G. S., Petruzzi, V., Watson, P. R., Schianchi, G., Bacciu, D., Mazzarello, V., Wallis, T. S., Rubino, S. Salmonella enterica serovar-host specificity does not correlate with the magnitude of intestinal invasion in sheep. Infect. Immun. 69, 3092-3099 (2001).
- Gerdts, V., Uwiera, R. R. E., Mutwiri, G. K., Wilson, D. J., Bowersock, T., Kindane, A., Babiuk, L. A., Griebel, P. J. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J. Immunol. Methods. 256, 19-33 (2001).
- Greibel, P. J., Davis, W. C., Reynolds, J. D. An analysis of the growth and differentiation of b cells isolated from follicles from ileal Peyer's patch of sheep. Immunology. 75, 601-607 (1992).
- Motyka, G., Greibel, P. J., Reynolds, J. D. Agents that activate protein kinase C resue sheep ileal Peyer's patch B cells from apoptosis. Eur. J. Immunol. 23, 1314-1321 (1993).
