Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Resumen

En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.

Resumen

Total de reflexión interna de fluorescencia (TIRF) microscopía es una técnica que permite el estudio de los acontecimientos que suceden en la membrana celular, por la imagen selectiva de moléculas fluorescentes que están más cerca de una sustancia alto índice de refracción, como el vidrio

Protocolo

Parte 1: La disección y aislamiento de células bipolares

1. Preparar las soluciones en la Tabla 2, el pH de timbres "(externo) de soluciones debe ajustarse a 7,4 con NaOH y el pH de la solución interna debe ser ajustado a 7,2 con CsOH. Proteja la solución interna de la luz con papel de aluminio y conservar a 4 ° C hasta su uso;
2. Dark-un pez de colores para adaptarse al menos 30 minutos antes de la disección;
3. Mientras que el animal se adapta oscuro, preparar 5 ml de la hialuronidasa (tipo hialuronidasa V, 1100 unidades / ml de bajo Ca ^{2 +} de Ringer, Sigma, St. Louis, MO) y 10 ml de la L-cisteína (0,5 mg / ml en el bajo Ca ^{2 +....}

Discusión

Las ventajas de los objetivos de tipo de microscopía TIRF son: 1) que proporciona seccionamiento óptico excelente mediante la restricción de la luz de excitación a una región estrecha en el plano focal del objetivo, minimizando de esta manera fuera del foco de luz, 2) ya que la luz disminuye exponencialmente con la distancia , el movimiento en sentido vertical se puede controlar con un cambio en la intensidad de la fluorescencia, 3) la colección de bajo consumo a través del objetivo de gran apertura numérica ^{de 1,5.}

El pr.......