Method Article

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

DOI:

10.3791/1387

⸱

September 23rd, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Construcción de una biblioteca fosmid con el ADN genómico aislado del medio ambiente de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada hipóxica se describe. La biblioteca clon resultante se recoge en placas de 384 pocillos y se archivan para la secuenciación de aguas abajo y la detección funcional mediante la aplicación de un sistema de recogida automatizada de la colonia.

Abstract

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La gran mayoría de los microbios en la naturaleza en la actualidad siguen siendo inaccesibles para los métodos de cultivo tradicionales. Durante la última década, la cultura independiente de la genómica ambiental (

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Construcción Fosmid biblioteca se ha dividido en cuatro pasos principales y sub-dividido en varias partes (ver Fig. 1 para un resumen).

Paso I (véase el protocolo "de extracción de ADN de 0,22 M filtros Sterivex" [3])

Parte 1: catalizadas por enzimas lisis celular

Parte 2: Purificación de ADN del medio ambiente mediante centrifugación en gradiente de densidad de CsCl y la recuperación de ADN

Parte 3: Control de calidad del ADN extraído por electroforesis en gel

Paso II

Parte 1: etapas enzimática....

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Discussion

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El procedimiento se describe cómo generar más eficiente una biblioteca fosmid gran inserción con el ADN genómico derivado de una muestra de las aguas costeras. Aguas arriba de extracción de ADN genómico se describe en un protocolo separado [3].

A medida que la producción fosmid-biblioteca es un proceso de varios pasos, el plan de al menos dos a tres semanas de tiempo para el procedimiento completo, incluyendo todos los pasos cuatro que se presentan. La extracción de ADN genómico es el paso m.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
No tengo nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. MT SL y con el apoyo de becas del Centro de TULA financiado por la Fundación para la Diversidad Microbiana y Evolución (CMDE). MT también recibió el apoyo de becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

....

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Materials

4Step IV

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Step II
CopyControl™ Kit de producción de bibliotecas FosmidEpicentre BiotechnologiesCCFOS110suficiente para generar 9-10 bibliotecas fosmid
SeaPlaque AgaroseCambrex50100
calefactora de agitaciónCorningPC-420D
1.0X Tampón
Sistema de electroforesis de campo pulsado CHEF Mapper XA que incluye módulo de refrigeración y bomba develocidad variableBio-Rad
λ Digestión de ADN-HindIII NewEngland BiolabsN3012S
MidRange I Marcador PFGNew England BiolabsN3551S
10,000X SYBR GoldInvitrogenS11494
envoltura de plástico para microondasSaran envoltura
Safe Imager transiluminadorInvitrogenS37102
GELase Agarose Gel-Digesting PreparaciónEpicentre BiotechnologiesG09100
bisturíFisher Scientific08-927-5D
Amicon Ultra-4 Unidad de filtro centrífugo con membrana Ultracel-10EMD MilliporeUFC801024
Microcon YM-30 Unidad de filtro centrífugo EMD Millipore42410
agua libre de nucleasasAmbionAM9932
Kit de ensayo Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 ensayos*#InvitrogenP7589
calentador digital de bloque secoVWR international12621-088
baño de aguaVWR international14231-854
centrífugaBeckman Coulter Inc.Rotor centrífugo Avanti J-E
Beckman Coulter Inc.Centrífuga de mesa JA 5.3
Eppendorf5415D
, 1,7 mL, transparentesAxygen ScientificMCT-175-C
Tubos de centrífuga de 15 mL Caldo
Step III
LBFisher ScientificBP 1426-2
Tampón
10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
3370)
Placa de 384 pocillos con tapaFisher Scientific07201157(3680)
Placas de Petri 100 D.E. x 15mm HFisher Scientific08-757-12
Placas de Petri 150 Ø x 15mmHFisher Scientific08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mmVWR international
glicerolSigma-AldrichG5516
cloranfenicolSigma-AldrichC0378
LB caldoFisher ScientificBP 1426-2
Difco AgarBD Biosciences214530
perlas de vidrioFisher Scientific10-310-1
QFill3GenetixX3050
LejíaJavex
etanolSigma-AldrichE7023
de 15 mLFisher Scientific430052
Selector de colonias QPixGenetixCabezal de recogida QPix2
(E. coli) GenetixX4006
placa de funcionamiento TAEpremiumTubos de microcentrífuga 430052 de dilución de fagos MgSOSigma-Aldrich M2643 criogénico Fisher Scientific 43048896 placa de pocillos con tapa Fisher Scientific CS003370( CABD351040 Tubos de centrífuga de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

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