Construcción de una biblioteca fosmid con el ADN genómico aislado del medio ambiente de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada hipóxica se describe. La biblioteca clon resultante se recoge en placas de 384 pocillos y se archivan para la secuenciación de aguas abajo y la detección funcional mediante la aplicación de un sistema de recogida automatizada de la colonia.
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Artículo de método
Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca
En este artículo
Resumen
Resumen
La gran mayoría de los microbios en la naturaleza en la actualidad siguen siendo inaccesibles para los métodos de cultivo tradicionales. Durante la última década, la cultura independiente de la genómica ambiental (
Protocolo
Construcción Fosmid biblioteca se ha dividido en cuatro pasos principales y sub-dividido en varias partes (ver Fig. 1 para un resumen).
Paso I (véase el protocolo "de extracción de ADN de 0,22 M filtros Sterivex" [3])
Parte 1: catalizadas por enzimas lisis celular
Parte 2: Purificación de ADN del medio ambiente mediante centrifugación en gradiente de densidad de CsCl y la recuperación de ADN
Parte 3: Control de calidad del ADN extraído por electroforesis en gel
Paso II
Parte 1: etapas enzimática....
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Discusión
El procedimiento se describe cómo generar más eficiente una biblioteca fosmid gran inserción con el ADN genómico derivado de una muestra de las aguas costeras. Aguas arriba de extracción de ADN genómico se describe en un protocolo separado [3].
A medida que la producción fosmid-biblioteca es un proceso de varios pasos, el plan de al menos dos a tres semanas de tiempo para el procedimiento completo, incluyendo todos los pasos cuatro que se presentan. La extracción de ADN genómico es el paso m.......
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Divulgaciones
No tengo nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. MT SL y con el apoyo de becas del Centro de TULA financiado por la Fundación para la Diversidad Microbiana y Evolución (CMDE). MT también recibió el apoyo de becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Paso II | |||
| Kit de producción de biblioteca de fósmidos CopyControl™ | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | suficiente para generar 9-10 bibliotecas de fósmidos |
| Agarosa SeaPlaque | Cambrex | 50100 | |
| placa calefactora con agitación | Corning | PC-420D | |
| buffer de electroforesis 1,0X TAE | |||
| Sistema de electroforesis en campo pulsado CHEF Mapper XA, incluyendo módulo de refrigeración y bomba de velocidad variable | Bio-Rad | ||
| Digestión de ADN-λ con HindIII | New England Biolabs | N3012S | |
| Marcaje PFG MidRange I | New England Biolabs | N3551S | |
| SYBR Gold 10.000X | Invitrogen | S11494 | |
| envoltura plástica para microondas | Saran premium wrap | ||
| transiluminador Safe Imager | Invitrogen | S37102 | |
| Preparación GELase para digerir geles de agarosa | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| bisturí | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 con membrana Ultracel-10 | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Unidad de filtro centrífugo Microcon YM-30 | EMD Millipore | 42410 | |
| agua libre de nucleasas | Ambion | AM9932 | |
| Kit de ensayo Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 ensayos*# | Invitrogen | P7589 | |
| calentador digital de bloque seco | VWR international | 12621-088 | |
| baño de agua | VWR international | 14231-854 | |
| centrífuga | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| rotor de centrífuga | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| centrífuga de sobremesa | Eppendorf | 5415D | |
| tubos microcentrífugos, 1,7 mL, transparentes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| tubos centrífugos de 15 mL | Fisher Scientific | 430052 | |
| Paso III | |||
| caldo LB | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| buffer de dilución de fagos | 10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | ||
| viales criogénicos | Fisher Scientific | 430488 | |
| Paso IV | |||
| placa de 96 pocillos con tapa | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| placa de 384 pocillos con tapa | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| placas de Petri 100 mm de diámetro x 15 mm de alto | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| placas de Petri 150 mm de diámetro x 15 mm de alto | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 x 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| cloranfenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| caldo LB | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Agar Difco | BD Biosciences | 214530 | |
| perlas de vidrio | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| lejía | Javex | ||
| etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| tubos centrífugos de 15 mL | Fisher Scientific | 430052 | |
| seleccionador de colonias QPix | Genetix | QPix2 | |
| cabezal de selección (E. coli) | Genetix | X4006 |
Referencias
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.
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Reimpresiones y permisos
