Summary
Ci descrivono un
Abstract
Distrofie muscolari sono un gruppo di malattie muscolari degenerative caratterizzata dalla progressiva perdita di cellule muscolari contrattili. Attualmente, non esiste alcuna cura disponibile. I recenti progressi nella biologia delle cellule staminali hanno generato nuove speranze per lo sviluppo di terapie cellulari basate efficace per il trattamento di queste malattie. Trapianto di vari tipi di cellule staminali etichettati con proteine fluorescenti nei muscoli di modelli animali distrofici è stato utilizzato ampiamente nel settore. Una tecnica non invasiva con la capacità di seguire il destino delle cellule trapiantate longitudinalmente può ulteriormente la nostra capacità di valutare l'attecchimento del trapianto da cellule muscolari trapiantate più accurato ed efficiente.
Nel presente studio, abbiamo dimostrato che in vivo l'imaging di fluorescenza è un metodo sensibile e affidabile per il monitoraggio GFP trapiantati (proteina fluorescente verde)-etichettati cellule nei muscoli scheletrici del mouse. Nonostante la preoccupazione di fondo per l'utilizzo di una luce esterna necessaria per l'eccitazione di proteine fluorescenti, abbiamo scoperto che utilizzando il mouse nude o eliminando i capelli con reagenti depilazione molto di questo problema è eliminato. Utilizzando una fotocamera CCD, il segnale fluorescente può essere rilevato nel tibiale anteriore (TA) muscolare dopo l'iniezione di 5 x 10 5 cellule sia da topi transgenici GFP o eGFP trasdotte cultura mioblasti. Per i muscoli più superficiali come l'estensore lungo delle dita (EDL), l'iniezione di un minor numero di cellule produce un segnale rilevabile. Intensità del segnale possono essere misurate e quantificate come il numero di fotoni emessi al secondo in una regione di interesse (ROI). Dal momento che le immagini acquisite mostrano chiari confini che delimitano la zona innestata, la dimensione del ROI può essere misurata come bene. Se le gambe sono posizionate in modo coerente ogni volta, i cambiamenti nel numero totale di fotoni al secondo per muscolare e la dimensione del ROI riflettere le variazioni del numero di cellule trapiantate e le dimensioni della zona innestata. Pertanto, il cambiamento nel muscolo stesso nel corso del tempo sono quantificabili. In vivo tecnica di imaging a fluorescenza è stata utilizzata principalmente per rintracciare la crescita delle cellule tumorogenic, il nostro studio dimostra che è un potente strumento che ci consente di tenere traccia il destino delle cellule staminali trapiantate.
Protocol
Preparazione delle cellule
- Cella di isolamento satellitare
- Sotto anestesia, i muscoli degli arti di topi transgenici GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) vengono rimossi. Dopo aver tagliato in piccoli pezzi, le cellule satellite sono dissociato enzimaticamente tramite l'incubazione del tessuto macinato con una soluzione di collagenasi dispasi al 2% per 1 ora a 37 ° C.
- Neutralizzare la digestione enzimatica con i media di crescita contenente Ham F-10 e il 20% FBS, dissociare il muscolo da triturazione ripetuto con una pipetta Pasteur. Le cellule vengono filtrati attraverso un colino cella (ø70-100μm) e poi placcato in maniera non rivestito piatto per 1 ora a 37 ° C.
- Rimuovere delicatamente il supernatante e la piastra su un piatto rivestito di collagene. Ripetere questa 1 ora passo successivo, per purificare il mioblasti. (Pre-piastra)
- Cambiare il supporto e la piastra delle cellule nel tempo. I mioblasti finale purificato sono coltivate in terreno contenente Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (mezzo di coltura) a 37 ° C con 5% di CO2, l'aria del 95%.
- Cultura ed espandere la mioblasti primari nel terreno di coltura con aggiunta di FGF base di 10 ng / ml.
- Per tutti gli esperimenti in vivo, abbiamo iniettare 5x10 5 cellule muscolari per TA.
- Durante la raccolta del mioblasti, si staccano le cellule utilizzando 0,25% tripsina / EDTA e lavate con PBS due volte. I numeri di cellulare vengono contati con un emocitometro e le cellule sono risospese in HBSS ad una concentrazione di 5x10 4 cellule / ml. Le cellule concentrate in HBSS sono immessi sul ghiaccio e iniettata entro 1 ora dopo la raccolta.
Imaging in vivo
- Maschio topi mdx all'età di 4-6 settimane sono acquistati da Jackson laboratorio e mantenuto in un impianto di stabulazione degli animali.
- Dopo circa una settimana di alloggio per l'ambiente, i topi sono pronti per essere impiantati con le cellule in coltura.
- Prima del trapianto delle cellule, il mouse è anestetizzato da una intraperitoneale (ip) iniezione della miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Poi i capelli intorno alla zona del muscolo TA viene rimosso applicando Nair alla gamba e in attesa di 30 secondi per pulirlo con acqua distillata.
- Mentre il mouse è ancora sotto anestesia, 5x10 5 celle in HBSS 10μl sono iniettata lentamente in ogni muscolo TA a 3 punti con un ago da 30 gauge.
- Dopo il punto 4, il mouse può essere regolarmente ripreso dal vivo in fluorescenza imaging. La fluorescenza immagini stazione Nightowl LB981 (di Berthold Technologies, Inc.), dotato di alta sensibilità accoppiamento di carica della telecamera, viene utilizzato per ottenere immagini dalla ostacolare zampe dei topi.
- Il giorno di imaging in vivo, per prima cosa controllare la ricrescita dei capelli sul muscolo TA. Se necessario, riapplicare Nair per rimuovere i capelli come sopra descritto, dopo anestetizzare il mouse con la miscela di ketamina e xilazina.
- Mentre il mouse è sotto anestesia, posizioniamo il mouse in posizione prona su un pezzo di nero non fluorescente carta (carta nera Artagain da Strathmore). Per esporre completamente il muscolo TA per immagini migliori, abbiamo nastro le zampe posteriori per la carta.
- Abbiamo posto il mouse nella camera di imaging e la posizione delle gambe posteriori per essere ripreso al centro del campo visivo della telecamera. Per prima cosa cambiare il filtro per le emissioni di prendere un tradizionale scala di grigi dell'immagine fotografica della gamba con un tempo di esposizione di 5 secondi. Regolare la posizione del mouse e messa a fuoco della fotocamera, se necessario. I parametri di imaging compreso il tempo di esposizione (1.250 m), altezza del campione (0,9 cm) ecc, sono mantenute costanti nel processo sperimentale.
- Siamo quindi passare nel filtro emissione appropriati per la lunghezza d'onda proteina fluorescente verde. Prendiamo l'immagine di fluorescenza con un tempo di esposizione di 1.250 ms e un certo numero di binning 1. Dopo l'imaging, il mouse viene rimosso dalla camera di imaging a una gabbia di aspettare il recupero.
- Per l'analisi, disegniamo una regione di interesse (ROI) oltre i segnali fluorescenti per misurare la loro intensità in termini di fotoni al secondo. Si misura anche la dimensione del ROI in termini di numero di pixel come un altro valore di quantificazione. Gli esperimenti di imaging può essere ripetuta ogni settimana o più frequentemente nel corso di un paio di mesi, se necessario, per acquisire dati longitudinali.
Alla fine degli esperimenti, il mouse è eutanasia e il muscolo TA viene raccolto per l'analisi istologica.
Discussion
Abbiamo creato una piattaforma di imaging affidabile e stabile per il monitoraggio delle cellule trapiantate fluorescenza etichettati nel muscolo scheletrico ospitare in questo studio. GFP-etichettata da GFP mioblasti di topo transgenico cavalletti di un tipo di cellule staminali adulte che saranno candidati per la terapia cellulare per il futuro. Una manipolazione costante tra cui il numero delle cellule, l'iniezione di cellule, sfondo chiaro, la posizione delle immagini e dei parametri della macchina è importante per ottenere immagini di alta qualità e soprattutto per l'analisi quantitativa.
Fluorescenza imaging ha numerose applicazioni nel campo della ricerca biomedica in quanto non è invasiva, facile da usare, ed ha un throughput elevato. Inoltre l'imaging di fluorescenza in grado di fornire una misura quantitativa basata sulla conta fotone, anche se a causa della attenuazione dispersione e l'assorbimento, la luce non può penetrare una grande distanza nel tessuto, che è una lacuna della tecnica. Gli sforzi sono in corso per usare giornalista rosso o vicino infrarosso per aumentare la profondità di penetrazione della luce.
Un altro vantaggio di imaging di fluorescenza è che è traducibile alle cliniche se il giornalista specifico fluorescente è omologato per uso umano. Rispetto al MRI, CT, PET e, fluorescenza imaging ha un'elevata flessibilità in quanto non richiedono hardware costosi e gli agenti di imaging. Un esempio è fluorescenza a base di endoscopio e micro-endoscopio che sono stati utilizzati nelle cliniche. Grazie alla combinazione di imaging di fluorescenza con altre modalità, ci aspettiamo di raggiungere la capacità di acquisire informazioni sia anatomiche e funzionali sui processi biologici sottostanti.
Acknowledgments
Il lavoro di Z e Y Wang Yang è stato reso possibile da concedere K02 AR051181 da NIAMS / NIH, borse di studio da Distrofia muscolare e della Harvard Stem Cell Institute per Y Wang. Il lavoro di Zeng Q e X Xu sono supportati da una sovvenzione del programma assegnato al Laboratorio di Imaging Ottico dal Brigham e l'ospedale delle donne. Gli autori desiderano ringraziare Liu Wen dal Dipartimento di Anestesia, BWH, per un aiuto tecnico al lavoro delle cellule.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
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