Un compartimiento de Multi-CNS neuronas-glia Co-cultivo de microfluidos Plataforma

Resumen

Hemos desarrollado una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma de microsistemas para la investigación in vitro de interacción axón-glia del SNC. La plataforma es capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo y se fabrica utilizando un nuevo desarrollo de macro / micro método de fabricación de híbridos.

Resumen

Presentamos una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma microsistema en el sistema nervioso central la investigación in vitro de interacción axón-glia, capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo de alto rendimiento. Hemos desarrollado un método de fabricación para crear nuevos dispositivos de microfluidos que tienen estructuras de escala micro y macro en el mismo dispositivo a través de un simple proceso de litografía suave, que permite la fabricación en masa con una buena repetibilidad.

El compartimiento multi-co-cultivo de microfluidos plataforma se compone de un compartimento de soma de las neuronas y seis compartimentos axón / glía de los oligodendrocitos (MCO). El compartimiento del soma y axón / glía compartimentos están conectados por las matrices de los axones de guía de microcanales que funcionan como barreras físicas para limitar soma neuronal en el compartimiento del soma, al tiempo que permite que los axones crezcan en axón / compartimentos glia. LB carga en compartimentos axón / glía sólo puede interactuar con los axones, pero no con el soma neuronal o dendritas, lo que permite localizadas las células de axón estudios de interacción. Los microcanales también permitió el aislamiento de fluidos entre los compartimientos, permitiendo seis experimentos independientes que se realizará en un solo dispositivo de alto rendimiento.

Soft-litografía con poli (dimetilsiloxano) (PDMS) es una técnica muy utilizada en microdispositivos biomédicos. Depósitos en estos dispositivos se define comúnmente por la perforación manual. Aunque la alineación simple, pobre y la naturaleza de tiempo del proceso hace que este proceso no es adecuado cuando un gran número de embalses que se creó en repetidas ocasiones. El nuevo método no requiere la perforación manual de reservorios, la superación de tales limitaciones. En primer lugar, siete depósitos de agua (profundidad: 3.5 mm) se realizaron sobre un poli (metacrilato de metilo) (PMMA) bloque con una máquina de fresado micro. Entonces, las matrices de las microestructuras cresta, fabricado en un sustrato de vidrio, se caliente en relieve contra el bloque de PMMA para definir microcanales que conectan el soma y el axón / glía compartimentos. Este proceso dio lugar a macro-escala de depósitos (3,5 mm) y la micro-escala de los canales (2,5 m) para coincidir con un solo maestro PMMA. Una réplica de PDMS que sirvió como maestro de molde se obtuvo utilizando la litografía blanda, y el último dispositivo de PDMS se ha replicado de este maestro.

Neuronas primarias de E16-18 ratas fueron cargados en el compartimento soma y cultivadas durante dos semanas. Después de una semana de cultivo celular, los axones se cruzó microcanales y formó la capa de red axonal sólo dentro de los compartimentos axón / glía. Axones crecieron de manera uniforme a lo largo de seis axón / glía compartimentos y LB de P1-2 ratas se han añadido a los compartimentos axón / glía a los 14 días in vitro para el co-cultivo.

Protocolo

Parte 1: Preparar un molde maestro para varios compartimientos de neuronas co-cultivo fabricación de dispositivos

1. El primer paso para fabricar el maestro de PMMA es hacer compartimentos 3,5 mm de profundidad. Un compartimiento soma y seis compartimentos axón / glía se definen en un bloque de PMMA utilizando una máquina de fresado micro (MDX-40, Roland o cualquier otra máquina de fresado CNC). PMMA maestro entonces se sonicated en alcohol isopropílico durante 10 minutos para eliminar los residuos.
2. Las matrices de 2,5 micras de alta cresta estructuras se modelan en un 50,8 mm x 50,8 mm placa de vidrio por un proceso de fotolitografía estándar, segu....

Discusión

Hemos desarrollado un compartimiento multi-plataforma de co-cultivo para el estudio de los mamíferos del SNC axón-glia interacción. Axones del SNC se aislaron con éxito de cuerpos celulares neuronales / dendritas, y oligodendrocitos fueron co-cultivadas con éxito en el interior del dispositivo. La densidad de las neuronas puede ser modificado por las aplicaciones, pero una concentración demasiado baja o demasiado alta puede causar que las células mueran. Además, es importante cambiar sólo la mitad de los medios de culti.......