El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

Resumen

Endoteliales que forman colonias células progenitoras (ECFCs) son una herramienta prometedora para estudiar la homeostasis vascular y la reparación. ^1,2 Este artículo presenta un novedoso método de suero de origen animal libres para el aislamiento y la expansión de ECFC de heparina para adultos de sangre periférica humana con agregados de lisado de plaquetas humanas (pHPL) disminuyendo el riesgo de la vacunación anti-bovina.

Resumen

Este documento presenta una estrategia de recuperación de la novela de las células endoteliales progenitoras que forman colonias (ECFCs) de heparina pero por lo demás no manipulado adultos sangre periférica humana dentro de una media de 12 días. Después de la expansión a gran escala> 1x10 ⁸ ECFCs se puede obtener por otras pruebas. Ventajosamente con pHPL el contacto de las células humanas con suero bovino antígenos pueden ser excluidos. Por citometría de flujo e inmunohistoquímica las células aisladas pueden ser caracterizados como ECFC y su funcionalidad in vitro para formar las estructuras vasculares, como puede ser probado en un ensayo de matrigel. Además, estas células pueden ser inyectada por vía subcutánea en un modelo de ratón para la formación de vasos funcionales, perfundidos in vivo. Después de la expansión a largo plazo y la proliferación de criopreservación, la función y la estabilidad genómica parece ser preservado ^3,4.

Este aislamiento de proteína animal libre y el método de expansión es de fácil aplicación para generar una gran cantidad de ECFCs.

Protocolo

A.) ECFC ISOLATON

DIA 1:

1. Antes de comenzar con el experimento de preparar el cultivo de células endoteliales de crecimiento medio mediano-2 (EGM-2). Suplemento de 500 ml de medio base endotelial-2 con heparina (1 ml de 1000 U / ml), solución de 5 ml 100x de penicilina / estreptomicina (todos Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-glutamina (2 mM concentración final de ), y 50 ml de lisado de plaquetas humanas agrupados (pHPL). A continuación, añadir 0,2 ml de hidrocortisona, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml de VEGF, 0,5 ml EGF, 0,5 ml de IGF-1 y 0,5 ml de ácido ascórbico (siempre como SingleQ....

Discusión

Este aislamiento novela y el método de expansión es un proceso sencillo y eficiente que es más eficiente y menos tiempo, evitando la separación de células (no hay gradiente de densidad es necesario) y menos costoso que las técnicas convencionales. Mediante el uso de contacto pHPL a los antígenos de la especie bovina y xenoimmunization siguientes supuestos se excluye. Durante el período de cultivo pequeños coágulos se pueden formar, causada por la pHPL. Basándonos en nuestra experiencia estos coágulos no afectan a la for.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio basal Endotelial-2	Lonza Inc.		500 ml
SingleQuots EGM-2	Lonza Inc.		EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, hidrocortisona, ácido ascórbico
Heparina sin conservantes	Biochrom AG		10 U/ml por EGM-2
L-Glutamina	Sigma-Aldrich		2 mM por EGM-2
Penicilina y Estreptomicina	Sigma-Aldrich		100 U/mL de penicilina y 100μg/mL de estreptomicina por EGM-2
Tripsina/EDTA 1 mM	Invitrogen		7 ml para matraz T75 70 ml para CF-4
PBS
Fábrica de células de cuatro capas (CF-4)	Corning
Embudo estéril	Corning
Matraz de cultivo T75cm2 (con tapón ventilado)	Corning
Tubos vacutainer de 6 mL (heparina sódica sin conservantes)	BD Biosciences		precargados con 108 UI/6 ml de heparina sódica sin conservantes
Tubos Falcon de 50 ml	Falcon BD
Stripetts de 5 ml	Costar
Stripetts de 25 ml	Costar
Squeezer	Costar
Filtro estéril de tamaño de poro 0,2	EMD Millipore		2 x 500 ml por EGM-2