Métodos para el Estudio de la barbo pez cebra maxilar

Resumen

El pez cebra maxilar barbos es un órgano sensorial que contiene tegumentario ectodérmica, mesodérmica y derivados de la cresta neural. Es importante destacar que, el barbo adultos pueden regenerarse después de una amputación proximal. Este video presenta el desarrollo del maxilar barbos y demuestra un protocolo quirúrgico para inducir la regeneración, seguida por la imagen recogida, incorporación y posterior de las muestras barbos.

Resumen

Barbos son apéndices de la piel sensoriales que se encuentran en los peces, reptiles y anfibios. El pez cebra, Danio rerio, desarrolla dos pares de barbillas, un par de cortos nasal y un par más largo del maxilar superior. Barbos tejido contiene células del ectodermo, mesodermo y el origen de la cresta neural, incluyendo células de la piel, las glándulas, las papilas gustativas, los melanocitos, los vasos circulatorios y los nervios sensoriales. A diferencia de la mayoría de los tejidos adultos, el maxilar barbos es ópticamente transparente, que nos permite visualizar el desarrollo y mantenimiento de estos tipos de tejidos en todo el ciclo de vida.

Este video muestra el desarrollo temprano del maxilar barbos (a partir de aproximadamente un mes después de la fertilización) y demuestra un protocolo quirúrgico para inducir la regeneración en el apéndice de adultos (> 3 meses después de la fertilización). En pocas palabras, el barbo superior izquierdo de un pez anestesiado se eleva con una pinza estéril, distal hasta el extremo caudal del maxilar superior. Un par de tijeras finas, primavera estéril se coloca en contra de las pinzas para cortar el eje de barbos en este nivel, estableciendo un punto de referencia anatómicos para el plano de la amputación. Crecimiento regenerador puede ser medido con respecto a este plano, y en comparación con el contralateral barbos. El tejido se regenera barbos rápidamente, alcanzando su máximo en el nuevo crecimiento de 2 semanas de la lesión.

Técnicas de análisis del regenerado barbos incluyen la disección y la incrustación de pares de barbos (regenerarse y control) en los pocillos de un gel de electroforesis de ADN estándar. Especímenes incrustados están convenientemente fotografiados bajo un microscopio estereoscópico para la morfología y la morfometría bruto, y se puede almacenar durante varias semanas antes de que las aplicaciones posteriores como la histología de parafina, muestras criostáticas, y / o inmunohistoquímica montar todo. Estos métodos de establecer el barbo maxilar como una novela en el sistema de tejido vivo para el estudio de la capacidad regenerativa de los múltiples tipos de células en el contexto genética del pez cebra.

Protocolo

Pez cebra cría

Pez cebra son alojados y criados de acuerdo con los métodos estándar de ^1. Pasado el período larval tarde, la etapa de desarrollo de un pez cebra puede ser medido por su longitud estándar (SL), o la distancia en línea recta en milímetros desde el punto más anterior del labio superior hasta la base de la aleta caudal (placa hipurales más posterior) ^2. En aproximadamente un mes después de la fecundación (10-12 mm SL), las barbillas nasal y maxilar aparecen brotes epiteliales como transparente cerca de las fosas olfatorias y en las esquinas posteriores de los maxilares, respectivamente. Como el pez cebra madura, el barbo se extienden en estrecho, como barba-apéndices. Debido a que el maxilar barbos es más grande (2-3 mm) y más fácil de manipular, el protocolo sólo se aplica a este apéndice particular; técnicas similares, sin embargo, podría ser adaptado para los más pequeños barbos nasal.

Barbo de recorte

1. Anestesiar a adultos de pez cebra en la etapa deseada (por ejemplo., 1.5-2.5 cm SL, ~ 3-6 meses post-fecundación) por inmersión en el 0,015% de MS-222 (el 3-aminobenzoato metanosulfonato) tamponado a pH 7,0 en el agua del sistema. Observe los movimientos hasta que deje de nadar y ventilación de enmalle se vuelve más lenta y regular. Dependiendo del tamaño del pez, una anestesia completa tarda aproximadamente 2-5 minutos.
2. Usando una red de pesca del acuario, la transferencia de peces de 1-3 en un momento en que una hoja doblada de la toalla de papel húmeda en una placa de Petri. Usando una espátula roma, orientar a los peces por lo que son paralelos a cada lado lateral izquierdo y otra arriba. Parte de las veces la toalla de papel húmeda en la parte caudal de los peces, que cubre todo el cuerpo hasta el opérculo (branquias cubiertas) para mantener la piel y las branquias húmedas durante el procedimiento.
3. Ver la placa de Petri bajo el microscopio estereoscópico, con bajo ángulo de luz incidente para iluminar la zona de la cabeza. Se centran en la base de la izquierda del maxilar barbos, que sobresale de la parte posterior ventral del maxilar superior (Fig. 1).
   
   Figura 1.
4. Comprender bien el eje de la ligeramente distal al borde del maxilar barbos. Elevar el eje de barbos e insertar las fauces de una tijera de primavera de punta fina justo por encima de las pinzas. Las tijeras se puede tocar a las pinzas para la estabilidad. Deslice las fauces de las tijeras a lo largo del eje de la barbilla hasta la punta se acerca al borde del maxilar superior. Cerca de las tijeras para cortar a través del eje barbos. El barbo amputada, que aún esté sujeta con las pinzas, se puede quitar para la fijación o la observación más.
5. Inmediatamente la transferencia de los peces a un pequeño tanque de agua limpia del sistema (~ 500 ml) que contiene una gota de azul de metileno para el control de infecciones fúngicas superficiales. Permiten a los peces a recuperarse durante la noche. A la mañana siguiente, vuelta a los peces en el sistema de crianza. Barbo de la regeneración es máxima después de 2 semanas.

Agar incrustación de pares coincidentes barbo

1. Recoger los peces por la técnica de eutanasia adecuados y fijar en un tubo de 50 ml de paraformaldehído al 4%-tampón fosfato salino (PBS) con agitación a 4 ° C durante la noche. El volumen de fijador debe ser por lo menos diez veces el volumen del tejido. Después de la fijación, la eliminación de residuos de paraformaldehído en un recipiente aprobado y enjuague el tejido a fondo en varios cambios de PBS.
2. Preparar en un frasco de vidrio de 250 ml 150 ml de agarosa al 2% (T _m ~ 37 ° C) en agua destilada. Calor con un microondas o una placa caliente, agitando periódicamente hasta que se disuelva. Equilibrar la solución fundida en un baño de 50-60 ° C el agua.
3. Montar un equipo de electroforesis en gel estándar mediante la colocación de un pequeño molde de gel de juntas (10 x 10 cm, aproximadamente 100 ml de volumen de gel) con firmeza contra los lados de la cámara de amortiguación. Añadir 2-4 dientes pequeños peines de la muestra (4 x 1,5 mm).
4. Sobre una superficie plana, verter la agarosa derretida en el molde para sólo cubrir la base de los panales, formando pozos muy poco profundos. Inmediatamente los restos de agarosa de nuevo en el baño de agua caliente, lo que se utilizará posteriormente para integrar el tejido (Pasos 9-12). Ponga una larga pipeta Pasteur de vidrio en el matraz para mantener la pipeta a la misma temperatura que la agarosa.
5. Deje que el gel para endurecer durante 20-30 minutos. Quitar los panales, luego retire el molde del gel que contiene el gel endurecido de la cámara de amortiguación. Firmemente la cinta de los lados abiertos del molde con cinta de gel de laboratorio por lo que el gel no se desliza. Esta cinta debe extenderse varios milímetros sobre la superficie de la agarosa, para que más de agarosa se puede agregar más adelante (Paso 13).
6. Coloque el molde del gel en el escenario de un microscopio estereoscópico. Ampliar un pozo vacío y llevar a los bordes en el foco.
7. Sobre la superficie del lado del bien de agarosa, una pipeta una gota de agua o un tampón que contiene las muestras de barbo fijo (por ejemplo, regenerar y control). Using pines doblados insectos, arrastre las muestras húmedas en el pozo y los empuja hacia el fondo. Orientar el barbo ejes paralelos entre sí y alineados en contra de lo contrario los bordes largos del pozo. Tensión de la superficie ayudará a mantener el tejido en su posición.
8. Cuando esté listo para insertar, utilice una pipeta de punta fina o la punta de un pañuelo de papel de laboratorio para eliminar el exceso de líquido del pozo. Trabaje con rapidez para no dejar que los tejidos se sequen.
9. Utilizando la pipeta Pasteur de vidrio caliente, con cuidado pipeta nueva agarosa fundida en y alrededor de las muestras para sellar el tejido de barbos en el lugar. No llene en exceso. Antes de la agarosa se endurece, hacer ajustes de última hora con las patas de insectos.
10. Coloque una etiqueta de papel ejemplar numerado al lado del bien y seguro que con una pequeña gota de agarosa.
11. Repita los pasos 6 a 10 para cada pozo de las muestras.
12. Si se desea para la calibración de la imagen, insertar una hoja de papel con una escala micrométrica impresos (por ejemplo, http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) en el fondo de un pozo vacío. Alise el papel en el fondo del pozo y se cubre con agua tibia de agarosa.
13. Después de todas las muestras se insertan, la superficie del gel será irregular, con caídas endurecido de agarosa. Colocar el gel en una superficie plana y suavemente vierta adicionales agarosa derretida hasta que la superficie superior es uniforme. Use la menor cantidad de agarosa necesaria para obtener una superficie lisa, demasiado oscuro agarosa se transmite la luz de la fotografía. Permitir que esta capa superior se endurezca.
14. El gel puede ahora ser fotografiados en el escenario de un microscopio estereoscópico para registrar la morfología bruto para cada par de barbos. Calibración de la imagen se obtiene mediante la fotografía la escala del micrómetro incorporado.
15. El gel se puede almacenar todo envuelto en toallas de papel húmedas y selladas en una bolsa de plástico a 4 º durante varias semanas.
16. Para su posterior análisis, los bloques de agar que contiene par emparejado de barbos se puede cortar el gel con un bisturí o una navaja y procesados ​​para histología de parafina o muestras criostáticas por métodos estándar ^3,4. Por otra parte, barbos individuales pueden ser diseccionados de la agarosa con agujas muy finas, se enjuagan en agua, y se procesaron para otras aplicaciones posteriores (por ejemplo, todo el montaje inmunohistoquímica o microscopía confocal).

Discusión

El pez cebra maxilar barbos es un sistema de tejido subutilizadas para estudiar el crecimiento, mantenimiento y regeneración de varios tipos de células en el pez cebra. Aunque el apéndice barbo no tiene analogía humana, los tipos de células que contiene son altamente conservadas, lo que hace posible el estudio de la piel, las glándulas, los melanocitos, los vasos circulatorios y los nervios en una estructura cilíndrica ópticamente transparente y simple anatomía. Similar a la aleta caudal bien estudiado, el tejido barbos se puede inducir la regeneración de la amputación. Utilizando la frontera del maxilar como un hito anatómico, el avión amputación puede ser colocado con precisión, lo que facilita la medición de los barbos rebrote. Para un operador con experiencia, cada cirugía es sólo unos pocos segundos. La recuperación es rápida, y hasta ahora hemos detectado ningún efecto a corto o largo plazo en el comportamiento de los peces. Pez cebra con un maxilar barbos nadar, comer y reproducirse tan eficazmente como no quirúrgicos de control, y tienen una supervivencia comparable a la época de la recogida de tejidos, hasta 6 meses después de la cirugía. El impacto psicológico de esta cirugía prevé que sea mínimo porque 1) las papilas gustativas extraoral realizado en el barbo también se encuentran en muchas otras partes del epitelio de los peces, incluyendo los labios, las mejillas y la cabeza ^5, y 2) diferenciar las papilas gustativas aparecen en el barbo regeneración dentro de las 72 horas (LeClair et al., datos no publicados). Esto hace que el maxilar barbos un sistema mínimamente invasivo para el estudio de la cicatrización de heridas, la revascularización y la reinervación en el contexto de un vertebrado adulto.

Después de la inducción quirúrgica de la regeneración, barbos se pueden recoger en los intervalos de medición morfométrica y / o el análisis microscópico de tejido fijado. Convenientemente, el maxilar barbos es aproximadamente de la longitud (2-3 mm) y diámetro (100-200 mm) de un embrión de pez cebra, para facilitar la aplicación de muchos de los protocolos estándar, incluyendo la histología de parafina, muestras criostáticas, inmunohistoquímica todo el montaje, e in situ hibridación. En conjunto, estas características hacen que el maxilar barbos una muy factible en un modelo in vivo para el estudio de la reparación de tejidos y la regeneración.

Materiales

Microscopio de Equipo

Un microscopio estéreo con disección de transmisión y la iluminación incidente de fibra óptica se requiere para recortar el barbo y la incrustación de agar.

Barbo de recorte

• Peces de agua del sistema
• 2 tanques de pez cebra cruce
• MS-222 (el 3-aminobenzoato metanosulfonato, Sigma Chemical # E10521-10G)
• estéril de 120 mm placa de Petri
• toallas de papel mojadas
• espátula de metal contundente
• Dumont # 55 Bio Inox Pinzas (Herramientas Artes Ciencia # 11255-20)
• Mini-Vannas primavera tijeras (Herramientas Artes Ciencia # 15000-00)
• azul de metileno agente antifúngico (Drs. Foster & Smith # CD-905781)
• pequeña red de pesca del acuario

Tejido de recogida e incorporación de agar

• 4% de paraformaldehído en 1x tampón fosfato salino (PBS-PF), hasta alícuotas en tubos cónicos de 50 ml y congelar a -20 ° C
• 1x tampón fosfato salino (pH 7,27 a 6)
• 250 ml frasco de vidrio
• Agarosa al 2% en agua destilada
• estándar pequeña en gel de agarosa equipo de electroforesis (tamaño de gel = ~ 10 cm cuadrados)
• pequeño peine de dientes electroforesis de la muestra (el tamaño de un peine de 4 x 1,5 mm)
• baño de agua caliente (50-60 ° C)
• laboratorio de la cinta
• negro esmaltado alfileres de insectos, de tamaño 000 (Fina Ciencia Herramientas # 26000 a 25)
• 02.01 titulares de pin (herramientas de Bellas Ciencia # 26.016-12)
• De 9 pulgadas pipeta Pasteur de vidrio
• pipeta de bulbo o la bomba
• laboratorio de los tejidos
• pequeñas etiquetas de papel
• (Opcional) de calibración impresa escala
• toallas de papel mojadas
• zip de cierre de las bolsas de plástico
• bisturí / hoja de afeitar (para cortar bloques de agar)