En este video-artículo se presenta un método para el aislamiento y purificación de Drosophila Neuronas periféricas con una rápida estrategia de asistencia con bolas magnéticas clasificación de células. ARN obtenido a partir de las células aisladas pueden ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores incluyendo el análisis de microarrays.
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Artículo de método
Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas
En este artículo
Resumen
Protocolo
Comentarios generales sobre clasificación magnética de bolas de Drosophila neuronas periféricas (El tiempo total para la conclusión del Protocolo: 2.5-3 horas)
Procedimientos estándar de laboratorio para el mantenimiento de un medio ambiente limpio, libre de ARNasa deben ser observadas en todo momento para evitar la degradación del ARN.
Cuando la cutícula larval de Drosophila se diseca y se coloca en el buffer de disociación celular, las neuronas periféricas son una de las celdas última a desprenderse de la cutícula. Hemos explotado esta propiedad y diseñado este protocolo para eliminar la ma....
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Discusión
El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para el aislamiento y purificación de las neuronas periféricas, que se adhieren firmemente a la superficie interna de la Drosophila cutícula tercer estadio larval con un cordón magnético de la estrategia de clasificación de células. A pesar de que han utilizado este protocolo para aislar específicamente Drosophila neuronas da, la aplicación de este protocolo para el aislamiento de otros tipos de células que se adhieren a la cutícula de las larvas o pupas de las etapas.......
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Agradecimientos
Agradecemos a los Dres. Yuh-Nung Jan y Grueber Wes para proporcionar poblaciones de moscas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen la F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust para el apoyo de esta investigación (DNC) y la Oficina de la Universidad George Mason Provost (EPRI).
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Materiales
Equipo
- (10) imanes de neodimio de bloque (K & J Magnetics, Inc., cat. # B444B), en su defecto dynamag ™ 2 (Invitrogen, cat. # 123-21D) puede ser utilizado.
- Glass Kontes tejido Grinder, 2 ml de capacidad de trabajo, con su correspondiente mano gran distancia (Cat. # 885300-0.002)
- Filtros de la célula, por ejemplo, MACS Pre-filtro de separación (Miltenyi Biotec, cat. # 130-041-407)
- 35 mm placas petri cubiertas con Sylgard (Dow Corning Corporation, cat. # 3097358 a 1.004)
- Herramientas de disección: dos pares de pinzas Dumont N º 5 (Herramientas Artes Ciencia, Cat # 11251-20).
- Vannas primavera microdisección tijeras (Herramientas Artes Ciencia, cat. # 15000 a 08)
- Pipetas (P-1000, P-100, P-10) con puntas desechables
- Hemocitómetro estándar para contar las células y la pureza de estimación
- Pipetas Pasteur con puntas pulidas al fuego de diámetro estándar, se redujo a aproximadamente el 50% del diámetro normal y reducido a ~ 25% del diámetro estándar para la trituración
- Para la mesa de microcentrífuga (1-16,000 (x) g)
- Vórtice
- Fluorescentes estereomicroscopio (a MZ16FA Leica fue utilizada en este protocolo)
Referencias
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling o....
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Reimpresiones y permisos
