Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Resumen

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Resumen

Una célula madre se define como una celda con la capacidad de los auto-renovación y generar progenie diferenciada múltiples. Las células madre embrionarias (ESC) se derivan del blastocisto del embrión temprano y son pluripotentes en la capacidad de diferenciación. Su potencial de diferenciación amplia ha convertido en el foco de muchas investigaciones se centraron en deducir cómo persuadirlos para generar tipos celulares de utilidad clínica. La derivación con éxito de células madre hematopoyéticas (HSC) de la ESC de ratón ha sido recientemente realizado y se puede visualizar en este protocolo de vídeo. HSC, podría decirse que la población clínicamente más explotadas de células, se utilizan para tratar una gran variedad de cánceres hematopoyéticos y trastornos. Sin embargo, muchos pacientes que podrían beneficiarse de la terapia de HSC no tienen acceso a los donantes adecuados. ESC podría proporcionar una fuente alternativa de células madre hematopoyéticas para estos pacientes. El siguiente protocolo establece una línea de base que ESC-HSC puede estudiar e informar a los esfuerzos para aislar a HSC de humano ESC. En este protocolo, el CES se diferencian como cuerpos embrioides (EBS) durante 6 días en suero disponible en el mercado pre-seleccionados para la diferenciación hematopoyética óptima. EBs luego se disocia y se infectaron con HOXB4 retroviral. Infectados procedentes EB-células son colocadas en OP9 estroma, una línea de células del estroma de médula ósea derivada de la bóveda craneal de M-CSF-/ - ratones, y co-cultivadas en presencia de la hematopoyesis la promoción de las citoquinas durante diez días. Durante este co-cultivo, las células infectadas ampliar en gran medida, lo que resulta en la generación de un grupo heterogéneo de 100s de millones de células. Estas células se pueden utilizar para rescatar a los ratones irradiados letalmente y reconstituir.

Protocolo

La diferenciación de células madre embrionarias

1. Recoger un frasco de cerca confluente de células madre embrionarias (ESC) a través de un tratamiento con tripsina ESC.
2. Resuspender las células en 5 ml de medio de diferenciación y de traslado a un T25 recubierto de gelatina. Se incuba a 37 ° C durante 45 minutos. Recuperar el sobrenadante y recoger las células por centrifugación.
   
   Nota: fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de las culturas ESC conectar fácilmente a la T25 no recubiertos de gelatina y por lo tanto se agotan de la cultura durante esta etapa de revestimiento. Si usted no es el cultivo de la ESC en MEFs, puede omitir ....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones deficientes en C57Bl/6 Rag-2/gamma-c	Animal	Taconic Farm
Agitador de placas	Herramienta	VWR international	33998-360	Agitador orbital de Ikaworks
Pipeta multicanal	Herramienta	VWR international	15000-174	ePet de BioHit
Tripsina ES	Reactivo	Invitrogen	15090-046	Tripsina al 0,25 % en PBS
Tripsina estándar	Reactivo	Invitrogen	25300-062	Tripsina-EDTA al 0,05 %
PBS	Tampón	Invitrogen	20012-027
Tampón de disociación sin enzimas	Tampón	Invitrogen	13151-014
Mezcla de enzimas de disociación	Tampón	Invitrogen	17104-019	500 mg de colagenasa IV
Hialuronidasa	Reactivo	Sigma-Aldrich	H2126	congelar en alícuotas de 500 μL y evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.
DNasa	Reactivo	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Sulfato de protamina	Reactivo	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
Medio de diferenciación de EB	medio			Consulte la receta en el archivo Protocol.doc adjunto
IMDM al 10 %	medio			Consulte la receta en el archivo Protocol.doc adjunto
IMDM al 10 % con citocinas	medio			Consulte la receta en el archivo Protocol.doc adjunto
anti-MEM al 20 %				Consulte la receta en el archivo Protocol.doc adjunto