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La construcción del vector de expresión y la expresión:
El vector de expresión pSESAME-Cre se construyó mediante la inserción de un fragmento de Cre-codificación en pSESAME a través de sitios de restricción NheI AvrII y con los métodos estándar de clonación. pSESAME codifica una proteína de fusión que consiste en una etiqueta de histidina, TAT-dominio, la secuencia NLS y Cre, abreviado HTNCre. Para la expresión de la HTNCre pSESAME Cre-se transformó en TUNER (DE3) Placi y se utiliza para preparar un stock de glicerol.
- Una cultura durante la noche fueron inoculados con una punta de pipeta recubiertas con bacterias transformadas a partir de las acciones de glicerol. La cultura a lo largo de la noche consistió en medio LB suplementado con 0,5% de glucosa [v / v] y carbenicilina a una concentración final de 50 mcg / ml y se dejó crecer a 37 ° C durante 16 horas.
- Al día siguiente, la densidad crecido durante la noche cultural se utilizó para inocular la cultura de expresión en una proporción de 1 a 40, y fue colocado en una incubadora a 37 ° C. La cultura la expresión de los medios de comunicación consistió en TB suplementado con 0,5% de glucosa [v / v] y la ampicilina a una concentración final de 100 mg / ml.
- En una OD 595 de 1,5 expresión de la cultura fue inducida con IPTG 0,5 mM durante 1 h.
- Posteriormente, las bacterias se recogieron por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos en un rotor SLA3000.
- Pellets de bacterias fueron almacenadas a -20 ° C hasta la purificación.
Purificación de proteínas penetran en las células:
- Pellets de bacterias congeladas se resuspendieron en 10 ml de solución amortiguadora de lisis por la cultura frasco de litro por 15 minutos a temperatura ambiente.
- La suspensión se incubó con 1 mg / ml de lisozima para otros 15 minutos mientras se mezcla a temperatura ambiente.
- 25 U / mL benzonasa se añadió más tarde y se incubaron durante la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Después de sonificación en hielo durante 1,5 minutos a 0,5 s pulsos a 45% de la potencia, 1 ml de tampón enfriado sal tartárico (TSB) por ml de suspensión se añadió cuidadosamente mientras se mezcla y se incubó durante 5 min en hielo. SDS-PAGE de muestras de la fracción de lisado (L) fue tomada.
- Lisado aclarado se obtuvo por centrifugación a 4 º C durante 30 minutos a 30.000 g. SDS-PAGE de muestras de las fracciones soluble (S) e insoluble (I) se tomaron.
- El sobrenadante fue transferido a nuevos tubos Falcon de 50 ml y se mezcla suavemente durante 1 hora a 4 ° C con 2 ml de 50% de Ni-NTA suspensión por litro de cultivo expresión inicial.
- La suspensión se empaquetó en una columna de flujo por gravedad EconoPac (SDS-PAGE muestra de flujo a través de la fracción (FT) fue tomada) y se lavó dos veces con 5 cama volúmenes de tampón de lavado. SDS-PAGE de muestras de las dos fracciones de lavado (W1 y W2) se recogieron.
- HTNCre que contienen fracciones se eluyeron con 3 dormitorios, volúmenes de tampón de elución de la muestra y de la fracción de eluido (E) para el análisis de SDS-PAGE fue tomada.
- Imidazol fue eliminado por diálisis frente a tampón de elución de la fracción de sal dos veces.
- La solución de proteína se concentró aún más por diálisis frente a tampón de glicerol en dos ocasiones. En todas las etapas de diálisis la relación de amortiguamiento para la muestra fue por lo menos 50. Este procedimiento dio lugar a una solución madre que contiene glicerol HTNCre a una concentración normal de entre 200 y 450 micras, es decir, 1 litro de cultivo de la expresión se traducirá en aproximadamente 12 mg de proteína. Muestra de las acciones de glicerol (GS) para análisis SDS-PAGE se recogieron. HTNCre solución de archivo puede ser almacenado a menos 20 ° C.
Figura 1: SDS-PAGE análisis de las muestras recogidas durante el proceso de purificación de la recombinasa Cre. Inducción de la expresión de Cre se indica por la banda dominante en la fracción de lisado. Aunque una parte de la proteína es la proteína insoluble Cre puede enriquecer como se ve en eluido y fracciones de glicerol de valores. L: Lisado, I: S insoluble,: sobrenadante, FT: de flujo continuo, W: Lavado, E: eluido, GS: Foto Gylcerol. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.
Proteína de transducción en madre embrionarias murinas (ES) las células:
- Células madre embrionarias que lleva un condicional β-galactosidasa reportero construir cinco fueron sembradas como células individuales usando TrypLE ™ Express para la disociación de las células adherentes. Después de 4 a 6 horas, las células se habían re-unido y el medio fue removido.
- Posteriormente, las células ES fueron incubadas con HTNCre medio que contiene de 16 horas.
- Una cantidad adecuada de proteínas HTNCre (correspondiente a 10 M) de las acciones de glicerol se diluyó en medio de ES y se filtró posteriormente estéril (0,22 m).
- Después de medio proteína de transducción fue cambiado de nuevo al medio de crecimiento normal.
- Después de dos días las células fueron lavadas con PBS y fijadas con 4% paraformaldehído (PFA) durante 10 minutos.
- Dos aditradicionales etapas de lavado con PBS fueron ejecutados antes de X-Gal tinción se realizó.
- Las células fijadas fueron cubiertos con una capa de solución de tinción X-Gal 6, y se incubó durante la noche a 37 ° C.
Los resultados representativos:
Al día siguiente, X-Gal solución de tinción fue aspirado y las células se cubrieron con una capa de PBS para el análisis de microscopía. 80 a 100% de las células recombinadas se puede observar dentro de las células madre embrionarias murinas juzgar por la actividad β-galactosidasa.
