Este protocolo se ilustra cómo los tintes sensibles al voltaje activar la grabación óptica de la actividad eléctrica de las redes neuronales intactos como los plexos de la cobaya sistema nervioso entérico, con una resolución ajustable que va desde una sola de las células ganglionares de varios circuitos.
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Artículo de método
Grabación óptica de la actividad eléctrica en el conejillo de Indias Redes entérica con tintes sensibles al voltaje
En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema nervioso entérico (SNE) es una red independiente con funciones definidas, capaces de realizar conductas complejas de forma aislada. Sus neuronas (10 a 25 micras de diámetro) están dispuestas en plexos que se limitan a distintos planos de la pared intestinal
Protocolo
Parte 1: preparación de tejidos
- Los preparativos del plexo submucoso y mientérico se encuentran aisladas por la disección secuencial desde el intestino delgado de 150-200g (2-3 semanas de edad) Hartley conejillos de indias que han sido anestesiados por inhalación de isoflurano y decapitado. Después de la eutanasia, el intestino delgado es extirpada y su contenido eliminado mediante el lavado de la luz con una solución caliente, oxigenada. Usamos Medio 199 suplementado con 25 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 y 2 mM de glutamina, y el pH ajustado a 7,4 (se refiere, a partir de ahora, como M199-DM), que ha sido previamente calentada a 37 ° C. Todo el resto d....
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Discusión
Este protocolo ha sido escrito con dos objetivos en mente. El primero es el de persuadir a otros investigadores que, gracias a los muchos avances tecnológicos de la última década, la grabación óptica de la actividad eléctrica usando tintes sensibles al voltaje se ha convertido en uno de los más poderosos, metodologías confiables y asequibles para el estudio de las redes neuronales intactos y, de hecho , podría ser fácilmente aplicado incluso en un laboratorio con recursos modestos. El segundo objetivo es promover el sis.......
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Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a DA Coulter (CHOP) por permitirnos usar sus dos fotones microscopio para adquirir las imágenes de 2 fotones que aparece al principio del video, y H. Takano por compartir con nosotros su experiencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | Con sales de Earle’s, sin L-glutamina, rojo de fenol y bicarbonato de sodio |
| Sylgard | Dow Corning | Kit de elastómero de silicona 184 | |
| Alfileres para insectos utilizados en la disección | F.S.T. | 26001-30 | |
| Pinzas Dumont | F.S.T. | 11203-23 o 11200-33 | |
| Tijeras de resorte Moria MC19/B Pascheff-Wolff | F.S.T. | 15371-92 | |
| Alfileres para sujetar el tejido durante el experimento | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Colagenasa VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Proteasa IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Suero bovino fetal | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, por Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamina 100X | GIBCO, por Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipino | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| Generador de estímulos de 4 canales | Multi Channel System MCS GmbH | Serie 2000 | |
| Bomba peristáltica | Rainin | Dinamax RP-1 de 2 canales | |
| Cámara de alta velocidad | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Relé lente / desmagnificador 1:10 | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Microscopio invertido | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Etapa fija Gibraltar con traductor motorizado X-Y | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canadá | PSSG--BX2 | |
| Electrodos matriciales lineales | FHC, Inc. | Hecho a medida | |
| Mesa activa de aislamiento de vibraciones | Halcyonics, Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Fuente de alimentación estabilizada con retroalimentación y ultra baja ondulación | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Filtro de calor | Schott AG | KG-1 | |
| Filtro de interferencia de alta calidad | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Espejo dicróico | Chroma Inc. | 565 nm (50 % de transmisión) | |
| Filtro paso alto | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Cortinas acústicas | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| Cámara CCD de alta resolución, con su propio controlador de cámara | Hamamatsu Corp. | ||
| Capturador de fotogramas para cámara de alta resolución | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Software de imagen para cámara de alta resolución | Data Translation | Global Lab Image/2 |
Referencias
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell....
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Reimpresiones y permisos
