Method Article

Medición de los coeficientes de difusión a través de dos fotones de fluorescencia de recuperación después de photobleaching

DOI:

10.3791/1636

⸱

February 26th, 2010

 , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Rochester, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo vamos a describir el procedimiento para medir coeficientes de difusión con multi-fotón recuperación de fluorescencia después de photobleaching. Vamos a empezar por alinear el láser a lo largo del camino óptico de la muestra y la determinación de los parámetros experimentales adecuadas, y luego continuar la generación de curvas de fluorescencia y por último montaje de recuperación.

Abstract

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Multi-fluorescencia de recuperación después de photobleaching es una técnica de microscopía para medir el coeficiente de difusión (o parámetros análogos de transporte) de las macromoléculas, y se puede aplicar tanto a

Protocol

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1. Alinear la óptica.

El equipo esencial de un experimento MP-FRAP son: un modo bloqueado fuente de láser, células Pockels (por haz de modulación), generador de impulsos, dicroicos, las lentes objetivo, la fluorescencia de emisión de filtro, tubo fotomultiplicador cerrada, y un sistema de registro de datos (fotones contra y multicanal escalador).

2. Determinará las competencias segura monitor.

  1. Atenuar el láser a un mínimo, pero razonable, para la generación de energía de fluorescencia en la muestra.
  2. Enfoque dentro de la muestra.
  3. Establecer un contador de fotones para integrar en un....

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Discussion

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El poder de la multi-fotón recuperación de fluorescencia después de photobleaching radica en su capacidad de conseguir que las muestras de espesor con una resolución en 3D. Desde su desarrollo en la década de 1990, MP-FRAP se ha utilizado para determinar el coeficiente de difusión (o parámetros análogos de transporte) en los cuerpos celulares, ex rebanadas gruesas de tejido vivo, y en el tejido vivo y el intersticio. En este artículo, presentamos el equipo necesario para realizar un e.......

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Acknowledgements

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Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa de la concesión era de esperanza Scholar (N º W81XWH-05-0396) y una beca Pew en el Premio de Ciencias Biomédicas de Edward B. Brown III.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ti:láser de zafiroNewport Corp.Mai Tai
Pockels CellConoptics350-80
Microscopio de escaneo láserOlympus CorporationFluoview
Espejo dicroico de paso cortoChroma Technology Corp.670 DCSX-2P
Tubo fotomultiplicadorHamamatsu Corp.HC125-02
Contador de fotonesStanford Research SystemsSR 400
Escalador/promediador multicanalStanford Research SystemsSR 430
Generador de pulsosResearch SystemsDG 535
FITC-BSAInvitrogen--
Stanford

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
  2. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.

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Two photon Fluorescence RecoveryFluorescence Recovery After PhotobleachingDiffusion Coefficient MeasurementLaser Beam AlignmentPockels Cell ModulationPhoton Counting AnalysisLabVIEW AutomationMATLAB Curve FittingAqueous Fluorescent DyeFluorescence Recovery Curve

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