Un dispositivo de microfluidos perifusion islote fue desarrollado para la evaluación de la dinámica de la secreción de insulina de los islotes y varias imágenes simultáneas de fluorescencia de la entrada de calcio mitocondrial y los posibles cambios.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion
En este artículo
Resumen
Resumen
Un dispositivo de microfluidos perifusion islote fue desarrollado para la evaluación de la dinámica de la secreción de insulina de los islotes y varias imágenes simultáneas de fluorescencia de la entrada de calcio mitocondrial y los posibles cambios. El dispositivo consta de tres capas: la primera capa contiene una matriz de micro pozos (500 m de diámetro y 150 m de profundidad) que ayudan a inmovilizar a los islotes durante la exposición al flujo y maximizar la superficie expuesta de los islotes, la segunda capa contiene una circular perifusion cámara (3 mm de profundidad, 7 mm de diámetro), y la tercera capa contiene un canal de entrada de mezcla que los aficionados a cabo antes de la inyección en la cámara de perifusion (2 mm de ancho, 19 mm de longitud y 500 m de altura) para la optimización de la eficiencia en la mezcla antes de entrar en la cámara de perifusion. La creación de los gradientes de la glucosa, asimismo, de una forma lineal, campana, y las formas cuadradas también se pueden crear en la red perifusion de microfluidos y se ha demostrado.
Protocolo
A. microfabricación de dispositivos de 3 capas perifusion microfluidos
Fondo del pozo de protocolo maestro (150 micras pozos profundos)
- Limpie la oblea con una cuchilla de afeitar, si es necesario. Limpie con acetona, metanol, y el IPA. Realizar el tratamiento de plasma de 50 vatios durante 30 s.
- Giro SU8-100 @ 2000 rpm. [Paso 1: 500 rpm, 10 s, 100 rpm / s, Paso 2: 2000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
[NOTA: no tienen la oblea con pinzas después de girar SU8] - Soft hornear la oblea a 65 ° C durante 20 min y 95 ° C durante 50 min.
- La oblea se expone a la luz UV a través de una máscara que desee. Dosis de ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los sistemas tradicionales de perifusion islote (macroescala y microescala) tienen algunas limitaciones, incluyendo complejos de configuración y diseño, altos requerimientos técnicos, y la dificultad para crear prescrito por el usuario gradientes químicos en el sistema. El sistema de microfluidos perifusion descrito aquí supera estas limitaciones con la simple geometría de diseño y fabricación. Más importante aún, este sistema puede ser integrado con el enfoque de imágenes de fluorescencia que proporcionan una herramien.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por AAUW internacional de becas para Adeola Adewola, NIH / CNRR (U42RR023245) a José Oberholzer, y el Proyecto de Diabetes de Chicago.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringas de 60 ml | BD Biosciences | ||
| colorante fluorescente Fura-2 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Colorante fluorescente Rodamina123 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucosa | Sigma-Aldrich | ||
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Tubos de silicona | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8 pulgadas | |
| Tubos Eppendorf de 1,5 ml | Fisher Scientific | ||
| Conectores en Y | Cole-Parmer | 1/16” & 4 mm | |
| Conectores de jeringa | Cole-Parmer | tapón luer hembra 1/16” | |
| Conectores rectos | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Conector de codo | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard bomba de jeringa | Harvard Apparatus | ||
| Dispositivo de perfusión | |||
| Placa calefactora | PMC | ||
| Termómetro | Omega Engineering, Inc. | ||
| Colector de fracciones | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Microscopio epifluorescente invertido | Olympus Corporation | IX71 | |
| dispositivo de carga acoplada | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
Referencias
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Análisis de la secreción de insulinaimágenes del flujo de entrada de calciomedición del potencial mitocondrialperfiles de gradiente de glucosapocillos de inmovilización de islotesconfiguración de microscopía fluorescentesistema de colector de fraccionescontrol de bomba de jeringaensamblaje del dispositivo de PDMS
