Automatizada de sangre de microfluidos Protocolo de lisis para el Enriquecimiento de la circulación las células nucleadas

Resumen

Un dispositivo de microfluidos automatizado fue desarrollado para la circulación de enriquecimiento de células nucleadas de sangre periférica mediante lisis de los eritrocitos que garantiza el aislamiento de la muestra de alta calidad sin pérdida de células.

Resumen

En este informe, el protocolo de un sistema automatizado de dispositivo de microfluidos lisis de sangre se detalla. Distribución de células nucleadas (CNC), incluyendo los leucocitos y las células endoteliales, proporcionan una plataforma ideal para un estado actualizado sobre el estado inmunitario de un individuo. El protocolo permite a los microfluidos para el enriquecimiento de la CNC, sin pérdida selectiva de células y la variabilidad de preparación de muestras, debido a los pasos mediada por el usuario. En pocas palabras, el protocolo incluye la fabricación de dispositivos, recolección de muestras, la configuración del dispositivo y la ejecución de la sangre a través de la cámara de microfluidos. Dentro del dispositivo de sangre entera se mezcla rápidamente con agua desionizada durante aproximadamente 10 segundos en un canal de 50 micrones x 150 micrones de microfluidos. En este tiempo los eritrocitos se lisan lapso debido a las condiciones hipotónicas. Estructuras de espina de pescado en la parte inferior del canal que se mezcle bien y la exposición de las células a un medio ambiente constante. Las células restantes se devuelven a condiciones isotónicas a la salida del dispositivo, fijo con paraformaldehído al 2%, se centrifuga para separar los residuos de eritrocitos de CNC, y suspendido en buffer de flujo para la tinción y análisis por citometría de flujo. Los resultados muestran el flujo de los diagramas de dispersión limpia citometría con poblaciones CNC salvo. Importancia de este dispositivo y el protocolo se presenta en el estudio y la comprensión de la patogénesis de la enfermedad mediante el análisis de las poblaciones de CNC. Por lo tanto, la automatización, la eficacia y la simplicidad del protocolo de microfluidos son demostrados.

Protocolo

Parte 1. Fabricación de dispositivos de microfluídica

Un molde maestro de silicio del dispositivo de microfluidos lisis fue creado usando técnicas de fotolitografía con el equipo en la Universidad de Louisville sala blanca [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) se utilizó para generar una máscara de transparencia (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) para crear réplicas negativas de los canales. El dispositivo de microfluidos lisis fue fabricado a partir del molde maestro de silicio mediante técnicas litográficas suave con el elastómero de poli (dimetilsiloxano) (PDMS, Dow Corning, Midland, MI). El elastómero con los canales repli....

Discusión

Un sistema automatizado de protocolo de microfluidos lisis de sangre ha sido reportado. Dentro del protocolo son pasos críticos dignos de mención. En la sección P.2.1, es importante desechar el frasco de sangre recogen la primera vez que la muestra contiene desalojados células endoteliales maduras que actúan como falsos positivos. También asegúrese de ejecutar la muestra de sangre una hora después de la recolección. Cebado del dispositivo de microfluidos en el apartado P.2.2, es importante para librar al principio de la.......